1 - ELECTROFORESIS + CátodoElectroforesis: migración de una partícula cargada sometida a un campo eléctrico - + Cátodo Ánodo

2 - ELECTROFORESIS + q Velocidad = E f Cátodo ÁnodoE: gradiente de potencial. E=V/d q: carga eléctrica de la partícula (depende de pH) f: coeficiente de fricción tamaño forma

3 Criterios de separación electroforética- + Cátodo Ánodo q (carga) Velocidad = E f (tamaño, forma) Separación por tamaño Separación por carga Separación por tamaño y carga

4 - ELECTROFORESIS + Cátodo Ánodo q (carga) Velocidad = Ef (tamaño, forma) Muestra Tampón: mantenimiento de pH y conductividad Soporte Equipo electroforético: Fuente de alimentación Cubeta de electoforesis

5 SOPORTES ELECTROFORÉTICOS- + Cátodo Ánodo Electroforesis libre (Arne Tiselius, 1937) En solución. Difusión, convección. Electroforesis de zona Soportes no restrictivos Papel, acetato de celulosa Almidón, agar, agarosa Soportes restrictivos Agarosa (ácidos nucleicos) Poliacrilamida

6 EQUIPOS ELECTROFORÉTICOSCátodo - + - + Ánodo

7 Carga eléctrica de la biomoléculasÁcidos nucleicos Proteínas

8 Lehninger. Principios de BioquímicaEnlace fosfodiéster Lehninger. Principios de Bioquímica

9

10 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa

11 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosaDNA viral DNA genómico RNA

12 ELECTROFORESIS MICROCAPILAR (Bioanalyzer(R))Lab-on-a-Chip: electroforesis miniaturizada y automatizada

13 ELECTROFORESIS MICROCAPILAR (Bioanalyzer(R))

14 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosaDNA viral DNA genómico RNA

15 Criterios de separación electroforética- + Cátodo Ánodo q (carga) Velocidad = E f (tamaño, forma) Separación por tamaño Separación por carga Separación por tamaño y carga

16 Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosaDNA hebra doble: condiciones no desnaturalizantes Tampón: Tris/Borato/EDTA (TBE) o Tris/Acetato/EDTA (TAE) Muestra: TBE o TAE, Glicerol, Azul de bromofenol RNA, DNA hebra simple: condiciones desnaturalizantes Tampón: MOPS + formaldehído Muestra: Formamida, Azul de bromofenol

17 Topología del DNA Se aisló el DNA circular del virus SV40 y se analizó por electroforesis en gel de agarosa. El resultado se muestra en la calle 1. a) ¿Por qué se separa el DNA en una electroforesis en gel de agarosa? ¿En qué se diferencia el DNA de cada banda? b) A continuación se incubó el DNA con topoisomerasa I durante 5 min y se analizó por electroforesis (calle 2). ¿A que tipos de DNA corresponde cada banda? c) Otra muestra se incubó durante 30 min con topoisomerasa I. ¿Qué significa el hecho de encontrar más DNA de las formas de movilidad reducida?

18 Electroforesis de DNA en geles de agarosa SSCP: single-strand conformation polymorphism

19 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE (PFGE): separación de moléculas de DNA de gran tamañopulsed field gel electrophoresis FIGE: field inversion gel electrophoresis TAFE: transverse alternating field electrophoresis RGE: rotating gel electrophoresis CHEF: Contour-clamped homogeneous electric field

20 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE (PFGE)Rotating gel electrophoresis (RGE) separation of 3000 to 6000 kb DNA Schizosaccharomyces pombe chromosomes. Run conditions: 50 V, 1.4 V/cm, 100 hrs, 100 angle, concatamated multiple runs: 2500 sec./50hrs, 3000 sec./50hrs, 0.5X TBE, 0.8% megarose (Clontech), 10 C.

21 ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSANTE (PFGE)Rotating gel electrophoresis (RGE) separation Saccharomyces cercevisiae chromosomes ( kb). Run conditions: 180 V, 5.1 V/cm, 34 hrs., 120 angle, sec. pulse ramp, 0.5X TBE, 1.2% GTG agarose, 10 C. Two combs were used on the same gel to load 32 samples, a maximum of 72 are possible

22 Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blotgel Nitrocelulosa

23 Hibridación de ácidos nucleicos: Southern blotTransferencia a nitrocelulosa o nylon Hibridación con sonda específica radiactiva Lavado y autoradiografía Electroforesis DNA Autoradiografía

24 Electroforesis DNA genómicoSouthern blot: RFLP Polimorfismo en la Longitud de los Fragmentos de Restricción Electroforesis DNA genómico Autoradiografía (B) (A) SONDA EcoRI EcoRI EcoRI (A) (B) EcoRI EcoRI

25 Hibridación de ácidos nucleicos: Northern blotElectroforesis RNA Autoradiografía

26 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS DEL SUERO EN ACETATO DE CELULOSASoporte no restictivo: Separación por carga

27 ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINA EN ACETATO DE CELULOSAAnemia falciforme: Mutación en hemoglobina A Mutación GAG -> GTG Glu -> Val

28 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE)

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30 Soporte restrictivo: Separación por tamañoGel de empaquetamiento (3% PA) Gel de separación (8-20% PA) Soporte restrictivo: Separación por tamaño

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32 ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA CON SDS (SDS-PAGE)Concentración de poliacrilamida Homogénea Gradiente Tampón de muestra Reductor (2-mercaptoetanol) No reductor Detección de las proteínas separadas Tinción (Azul Coomassie, sales de plata) Fluorescencia Inmunodetección

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34 ISOELECTROENFOQUE

35 ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL

36 ELECTROFORESIS CAPILARElectroforesis capilar de alta resolución (HPCE) Soporte: capilar cm, micras de diámetro Voltaje: >500 V/cm Automatizada, gran resolución Detector: Espectrofotómdetro, fluorímetro, espectrómetro de masas …

37 ELECTROFORESIS CAPILARCZE: de zona. Medio líquido, homogéneo, capilares con carga uniforme CGE: en gel. Poliacrilamida, PA lineal, metilcelulosa. CIEF: Isoelectroenfoque capilar. Isotachophoresis (ITP). Electrokinetic Chromatography (EKC). Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC OR MEKC. Micro Emulsion Electrokinetic Chromatography (MEEKC). Non-Aqueous Capillary Electrophoresis (NACE). Capillary Electrochromatography (CEC.

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39 Secuenciación de DNA Método de Sanger automatizadoOligo: 5´--C T T A A - Molde: 3´--G A A T T C G C T A A T G C ---5´ - DNA polimerasa - Nucleótidos dATP, dCTP, dGTP, dTTP -Terminadores fluorescentes ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP Separación de los fragmentos de DNA marcados, mediante electroforesis capilar 5´--C T T A A G -3´ 5´--C T T A A G C -3´ 5´--C T T A A G C G -3´ 5´--C T T A A G C G A -3´ + Detector de fluorescencia 5´--C T T A A G C G A T -3´ láser 5´--C T T A A G C G A T T -3´ G C G A T T A C G 5´--C T T A A G C G A T T A -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C -3´ 5´--C T T A A G C G A T T A C G -3´

40 CENTRIFUGACIÓN, CÁLCULO DE FUERZA CENTRÍGA RELATIVA¿A qué fuerza centrífuga relativa equivalen, en un rotor de 10 cm de radio, las siguientes velocidades de giro? 1.000 rpm rpm rpm rpm