1 2007 Desarrollo Profesional

2 Transformación de pGLO™ y Purificación de la Proteína GFP (Green Fluorescent Protein) InstructoresEssy Levy, M.S. Coordinadora de Programas de Hughes Scholars UCSD, San Diego CA Julie Mathern BioEducation Product Manager Bio-Rad Laboratories, Hercules CA

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4 ¿Para que enseñar la transformación genética?Una herramienta poderosa para el aprendizaje Parte de los estándares nacionales curriculares Varias extensiones de practicas de laboratorio Conexiones con el mundo real Conexiones con carreras científicas académicas y en la industria

5 Dogma Central de la Biología MolecularADN ARN Proteína Característica

6 Conexiones con el mundo realGFP es un marcador visual Estudio de los procesos biológicos (ejemplo: la síntesis de las proteínas) Localización y regulación de la expresión de un gen Movimiento celular El destino celular durante el desarrollo Formación de los diferentes órganos Marcadores genéticos útiles para identificar organismos transgénicos

7 Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™Ventaja del uso del kit pGLO de Bio-Rad Basado en los estándares curriculares Currículo comprensible para las investigaciones basadas en el proceso del cuestionamiento Compatible con un periodo de clase de 50 minutos Proporciona una clase entera de 32 estudiantes (4 estudiantes por grupo) Costo económico Resultados exitosos en las manos de los estudiantes Seguro para uso en el aula ¡Resultados tangibles! Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

8 Procedimiento TransformaciónDay 1 Day 2

9 Horario para el Taller de GFPIntroducción Transformación de bacteria con el plásmido de pGLO Inducción de la expresión de GFP con arabinosa y la subsecuente purificación de la proteína

10 Kit de Transformación de Bacteria con pGLO™

11 ¿Que es una transformación?GFP Absorción de ADN exógeno; frecuentemente un plásmido circular Lactamasa beta Resistencia a la Ampicilina

12 ¿Que es un plásmido? Un pedazo circular de ADN que se replicaautónomamente Evolucionado originalmente en bacterias Puede expresar resistencia a un antibiótico o puede ser modificado para expresar una proteína de interés

13 Las diferentes caras de un plásmidoMicrografía de transmisión de electrones Gel de agarosa Representación Grafica

14 Plásmido pGLO Lactamasa Beta -Resistencia a la ampicilinaLa proteína GFP (Green Fluorescent Protein) Aequorea victoria gen de medusa araC: Regulador Regula la trascripción de GFP

15 Transformación con pGLOPared celular GFP Cromosoma Bacteriano (ADN) Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina) Plásmidos de pGLO

16 ADN Bacteriano Célula de Bacteria Plásmido de ADN ADN Geonómico

17 Regulación de TrascripciónOperón de lactosa Operón de Arabinosa Plásmidos de pGLO

18 Regulación de TrascripciónOperón lac Operón ara LacI araC B A D Z Y A Efector (Arabinosa) Efector (Lactosa) araC B A D LacI Z Y A ARN Polimerasa ARN Polimerasa Z Y A araC B A D

19 Regulación de la expresión del genOperón ara Operón GFP araC araC Gen de GFP B A D Efector (Arabinosa) Efector (Arabinosa) araC B A D araC Gen de GFP ARN Polimerasa ARN Polimerasa araC B A D araC Gen de GFP

20 Métodos de TransformaciónElectroporación Un choque eléctrico resulta en que la célula sea permeable al plásmido ADN Cloruro de Calcio y Choque Térmico Las células químicamente competentes absorben el ADN después del choque térmico

21 Proceso de TransformacionSuspender las colonias en la Solución de Transformación Añadir el plásmido pGLO ADN Incubar los tubos en hielo ice Choque térmico a 42°C y colocar en hielo Incubar con caldo nutriente LB Extienda la suspensión por la superficie de las placas

22 ¿Porque es importante cada paso de la transformación?Base O O CH2 Azúcar La solución de transformación = CaCI2 La carga positiva del los iones de Ca+2 neutralizan la carga negativa de los fosfatos del ADN O Ca++ O P O Base O O CH2 Azúcar OH

23 ¿Porque es importante cada paso de la transformación?Pared Celular GFP 2. Incubación en hielo -disminuye la fluidez de la membrana celular 3. Choque térmico -incrementa la permeabilidad de la membrana celular 4. La recuperación con LB permite la expresión de lactamasa beta Lactamasa Beta (resistencia a ampicilina)

24 ¿Que es el caldo nutriente de LB?Caldo Luria-Bertani (LB) Un medio que contiene los nutrientes para el crecimiento bacteriano y la expresión de los genes de interés carbohidratos aminoácidos nucleótidos Sales Vitaminas

25 ¿Crecer? ¿Brillar? Siga el protocolo ¿En que placas crecerán colonias?¿Que colonias brillarán? LB/Amp LB/Amp/Ara LB

26 Medida de Volumen