1 ABP 32-36 Aprenent amb el TGN1412 Grup E.Arumí H, Ballestero M, Borralleras C, Codina M, Domènech A, Español N, Guixe M, Joyera M, Moscoso M, Suarez M

2 INTRODUCCIÓ La segona part d’aquest ABP segueix tractant el tema del TGN1412 que vam tractar des del punt de vista toxicològic i bioètic a la primera part. L’assaig en humans va acabar catastròficament. En aquesta segona part, volem hipotetitzar quines van ser les possibles causes que van produir aquestes conseqüències desastroses a l’assaig en fase I fet a Gran Bretanya. 3. Què és el TGN1412? EL TGN14 12 és un anticòs superagonista anti-CD28. Es van fer estudis amb rates i amb primats no-humans abans de fer l’estudi de fase I on es va administrar TGN1412 a sis voluntaris sans que en pocs minuts van desenvolupar tots ells una fallada multiorgànica i una massiva alliberació de citoquines (cytokine storm, CRS). Aquest impacte tan bestia sobre el sistema immune no va poder ser predit amb els estudis preclínics amb animals.

3 INTRODUCCIÓ En rates, s’administra JJ316:primeres 48 hores: ona ràpida i transitiva cèl·lules T i les cèl·lules T reguladores. ona més tardana, es produeix l’activació de cèl·lules T reguladores. En primats no-humans, cynomolgus i rhesus, provoca una expansió transitòria de cèl·lules CD4+ i CD8+ i proliferació de cèl·lules T CD4+ i CD25+. Fases clíniques en humans després de la injecció de TGN1412: Primera: alts nivells de citoquines en sang Segona: lesió pulmonar, lesió renal i coagulació intravascular disseminada Tercera: limfopènia i monocitopènia severa a la sang Quarta: shock cardiovascular perllongat i síndrome de distrès respiratori agut Introducció TGN1412. Els events clínics, de laboratori i immunològics després d’haver injectat intravenosament el TGN1412 van ser catastròfics i han estat dividits en 4 fases: primera: una resposta inflamatòria sistèmica que consisteix en uns nivells alts de citoquines en sang. Està acompanyat de mal de cap, mialgia, nausees, diarrea, eritrema, vasodilatació i hipotensió. Segon: infiltrats pulmonars i lesió pulmonar, insuficiencia renal i coagluació intravascular disseminada. Tercer: limfopènia i monocitopènia severa a la sang Quart: shock cardiovascular perllongat i síndrome de distrès respiratori agut A les rates, es va administrar un anticòs superagonista anti-CD28 (no humanitzat): el JJ316. Aquest provoca dues ones d’activació de cèl·lules T: En les primeres 48 hores: una ona ràpida i transitiva que afecta a les cèl·lules T i a les cèl·lules T reguladores. I una ona més tardana, on es produeix l’activació de cèl·lules T reguladores. Amb concentracions baixes de CD28SA es va induir una expansió no específica de les cèl·lules T reguladores sense causar limfocitosi. A més, també va causar una redistribució de les cèl·lules T en 48 hores amb una fase tardana on s’activaven les cèl·lules T reguladores. Es va usar per tractar malalties autoimmunes en rates. Als primats no-humans es produeix una expansió transitiva de cèl·lules CD4+ i CD8+ i proliferació de cèl·lules T CD4+ i CD25+. Es van detectar nivells modestos de citoquines proinflamatòries als cynomolgus. En dosis altes de TGN1412, es van detectar nivells moderats de IL-2, IL-5 i IL-6 en sèrum amb cap canvi en els nivells de IL-4, IFN-γ, o TNF-α. Dosis baixes de TGN1412, es van veure canvis en les dosis de IL5 i IL6.

4 INTRODUCCIÓ Després de veure les diferents respostes en els diferents organismes, ens preguntem què va ser diferent en humans respecte els monos i les rates. Hipotetitzarem sobre això durant el treball.

5 ANTICOSSOS Proteïnes plasmàtiques globulars: Glicoproteïnes del tipus γ globulina Cada cadena  constituïda per dominis estructurals (Ig): de 70 a 110 Aa Unió específica entre Ac–Epítop: Acoblament induït Sintetitzats pel Limfòcit B Classificació Ig: segons mida i funció Tipus d'Ig es denominen Isotips en mamífers (α, δ, ε, γ i μ) Primer, començarem a analitzar el problema: el TGN1412 hem dit que era un anticòs superagonista anti-CD28. Cal tenir clar què és un anticòs i de quines parts està format i així podrem aproximar-nos millor al problema que se’ns presenta.

6 ANTICOSSOS Regió Fab i Fc Parts amb funcions úniques:Fragment d’unió a l’Ag (Fab) Conté el lloc d’unió Compost d’un domini constant i variable de les LC i HC Fragment constant (Fc) Modela l’activitat de la cèl·lula 2-3 dominis constants de HC La regió (locus) del cromosoma que codifica un anticòs és gran i conté diversos gens diferents per cada domini del anticòs - en els humans, el locus que conté els gens per les cadenes pesants es troba al cromosoma 14 i els locus que contenen els gens lambda i kappa de la cadena lleugera i es troben als cromosomes 22 i 2. Un d'aquests dominis és conegut com "domini variable" i està present a totes les cadenes lleugeres i pesants dels anticossos, però pot ser diferent entre els diferents anticossos generats pels diversos llinatges de limfòcits B. Les diferències entre els dominis variables es localitzen en tres bucles coneguts com regions hipervariables (HV-1, HV-2 i HV-3) o regions determinants de la complementarietat (CDR1, CDR2 i CDR3). Les CDR es mantenen entre els dominis variables per regions de marc conservat. El locus de la cadena pesant conté uns 65 gens de domini variable diferents, que difereixen en la seva CDR. Combinant aquests gens amb diversos gens d'altres dominis es genera un gran contingent d'anticossos amb un alt grau de variabilitat. Aquesta combinació es denomina "recombinació V(D)J".[

7 ANTICOSSOS Unitat bàsica funcional: Monòmer (molècula amb forma d’Y)Unitats estructurals bàsiques: - 2 C. Lleugeres + 2 C. Pesades - Unió per ponts disulfur Regió de l’àpex: - Extremadament variable (Regió Hipervariable) Milions d’Ac diferents - Regió d’unió amb l’Antígen (diana)

8 ANTICOSSOS Humanització de l’anticòs: Anticòs humàCDRs (complementary determining regions) de ratolí Un anticòs humanitzat és un anticòs produït al laboratori a partir de la combinació d’un anticòs humà amb un de murí, per tal d’evitar la resposta HAMA. Per humanitzar un anticòs, s’agafa l’anticòs humà i es canvien les CDRs d’humans pels CDRs murins.

9 Tècniques d’humanitzacióANTICOSSOS Humanització de l’anticòs: FR libraries Guided selection FR shuffling Humaneering Racionals Empíriques CDR-grafting Resurfacing Superhumanization HSC optimization Tècniques d’humanització Pel que fa a les tècniques utilitzades per a la humanització dels anticossos, les podem dividir en dos grups: - Les empíriques: que es basen en la creació de grans llibreries i es procedeix a la selecció de les variants necessàries Dins d’aquest grup es troben les tècniques q apareixen a l’esquema (jo crec q no és necessari explicar-les, però aquí us poso una minifrase de cada tècnica per almenys pder dir alguna cosa si pregunten) FR libraries: construcció de gran llibreria combinatorial i selecció Guided selections: permet obtenir anticossos totalments humans FR shuffling: tots els FRs es combinen amb CDRs en comptes de crear llibreries Humaneering: identificació experimental dels determinants mínims d’especificitat - L’altre grup tenim les tècniques que anomenem racionals: aquestes consisteixen en formar un grup petit de variants que es generen a partir de la informació tant estructural com de sequencia CDR grafting

10 Non-human Residues Retained or Back MutatedANTICOSSOS Humanització de l’anticòs: Non-human antibody Region to graft Human Framework Donor Non-human Residues Retained or Back Mutated CDR HL aCDRs SDR SDRU Fix Best fit Consensus Germline Multiple VZ Clinical residues Others CDR-grafting és una tècnica d’humanització d’anticossos (dins de les racionals) que consta de 3 etapes: (és la tècnica utilitzada per produir TGN1412) 1r. Determinació de les regions hipervariables en l’anticós no humà (murí). Aquestes regions es troben dins del domini variable de l’anticòs i en concret formant part del loops. Aquestes són bàsicament CDR1,2 i 3, concretament la 3 és la que presenta més variablilitat. Aquetes regions són les que confereixen especificitat en la unió antigen – anticos i sempre s’intenen que continguin un nombre reduit de residus aminoacídics per tal de evitar al màxim una possible reacció adversa. 2n. Selecció de la regió constant de l'anticòs humà. Aquesta regió correspon a la regió constant de IgG* i es seleccionada en funció d’una elevada homologia de seqüència entre l'anticòs humà i l'anticòs no-humà. Es important dir que a diferència del domini variable, el domini constant, existeix una alta similaritat de seqüència entre les diferents Igs fet que fa pensar que els gens que codifiquen per aquestes regions procedeixen d’un ancestre comú que es va anar duplicant donant lloc a les diferents regions constants. Un cop seleccionada la regió constant; s’amplifiquen els CDRs murins amb seqüències homologues dels FRs humans. 3r. Mutagènesis dirigida en CDRs amb l’objectiu de restablir l’afinitat la qual es troba disminuïda després de realitzar CDR-grafting. Finalment els cDNA resultants es posen en vectors d’expressió i s’introdueixen a la cèl·lula hoste per tal de produir els anticossos. *IgG: En principi tots els isotips de IgG són útils per aplicació terapèutica. Tots presenten una acció neutralitzadora, de bloqueix o desctructiva i difereixen per la seva capacitat superagonista. Tenint encompte aquestes punts van seleccionar el isotip IgG4 .

11 INTRODUCCIÓ Per activar les cèl·lules T calen dues senyals: 1. antigen depenent: via TCR in vivo: complexes pèptid-MHC in vitro: estímul primari mediat per TCR 2. antigen independent: proveïda pels receptors coestimuladors in vivo: lligands naturals (CD80 i CD86) s’uneixen a CD28. in vitro: anticossos CD28 Com anem repetint, el TGN1412 és un anticòs superagonista anti-CD28. Cal tenir clar què significa ser un superagonista de CD28. per entendre-ho, ens centrarem en la activació de les cèl·lules T. Per activar aquestes cèl·lules, necessitem dues senyals simultànies: La primera és antígen-depenent i és via TCR (el receptor de la cèl·lula T) La segona és antigen INdependent i és proveïda pels receptors coestimuladors com és CD28. In vivo, la primera senyal està mediada pels complexes pèptid-MHC que s’uneixen al TCR mentre que la segona senyal s’inicia després de que els lligands naturals del cd28, com cd80 i cd86, s’uneixin a ell (aquests s’expressen en cèl·lules dendrítiques). En condicions in vitro, la segona senyal pot ser mimetitzada pels anomenats anticossos de cd28. Aquests agents recolzen l’activació de les cèl·lules T només quan hi ha l’estímul primari mediat per TCR. S’han descrit un nou grup d’anticossos cd28 que s’anomenen superagonistes cd28 que, contràriament als anticossos cd28 convencionals, són capaços de provocar l’activació dels limfòcits T de rata, ratolí i humà únicament amb la unió al cd28. Superagonistes CD28: provoquen activació limfòcits T ÚNICAMENT amb la unió al CD28.

12 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN1412 amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

13 HIPÒTESI 1 Assajos: 1a hipòtesi:ESPÈCIE DOSIS RESPOSTA Mus musculus 0,3 -10 mg/kg Negativa Macaca mulatta 50 mg/kg Lleu Homo sapiens 0.1 mg/kg Positiva 1a hipòtesi: Els diferents efectes poden ser deguts a diferències en la seqüència de CD28 en la zona d’interacció amb TGN1412 Com que veiem que hi ha diferents respostes en les diferents espècies vam pensar que la interacció entre el TGN1412 i el receptor (CD28) era diferent degut a diferències en la seqüència de la zona d’interacció del CD28 amb el TGN1412. Per tal d’esbrinar-ho vam dur a terme l’alineament entre les seqüències de les diferents espècies.

14 HIPÒTESI 1 Vam trobar un article on es estan indicats els residus importants en la interacció amb el lligand natural i amb el superagonista. En el nostre cas ens interessa la regió d’interacció amb el superagonista, ja que el TGN1412 és un superagonista de CD28. Aquesta regió es veu de color taronja. Això ho hem fet servir per localitzar la regió d’interacció amb els nostres alineaments. Riley JL, June HC. The CD28 family: a T-cell rheostat for therapeutic control of T-cell activation. Blood. 2005; 105: 13-21

15 HIPÒTESI 1 Alineament CD28 humà vs CD28 muríFent l’alineament entre cd28 humà i murí veiem que la zona d’interacció en les dues sp és totalment diferent. Per tant, la hipòtesi de que les diferències en els efectes era deguda a diferències en la seqüència no pot ser rebutjada. No obstant, hem de tenir en compte que en els ratolins no se’ls va administrar TGN1412 ja que és un anticòs humanitzat, per tant, és lògic que si administressin TGN a ratolí no tindria efecte ja que els CDR de l’Ac són humanitzats i per tant no interaccionarien amb la seqüència d’interacció del CD28 de ratolí. Per tant, comparar el cd28 humà amb el murí no té cap sentit. El que sí que té sentit és alinear el cd28 humà amb el de macac, ja que en aquests sí que se’ls va administrar el mateix TGN que en humans. El pas següent és fer el model del TGN1412. Primer ens vam plantejar quines són les diferents tècniques que permeten determinar l’estructura d’una proteïna. Seqüències diferents  Efectes diferents La hipòtesi en ratolí no té sentit !!!

16 TÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURAResolució intermitja Crio-microscopia electrònia RMN d’estat sòlid Alta resolució Cristal·lografia de raigs X RMN multinuclear i multidimensional Baixa resolució Tècniques espectroscòpiques Absorbància UV-Vis Fluorescència Dicroisme circular Espectroscòpia d’infraroigs Ressonància paramagnètica electrònica (EPR) R Ressonància magnètica nuclear de 1H(1D/2D) Difusió traslacional Ultracentrifugació analítica Dispersió de la llum Cromatografia de filtració en gel Hi ha múltiples tècniques per a determinar l’estructura de les proteïnes. Aquestes es poden classificar segons la seva resolució, així hi ha tècniques de baixa resolució, de resolució intermitja i d’alta resolució, com les que hem vist a classe. Nosaltres ens centrarem en les tècniques marcades amb color taronja: dins les espectroscòpiques (que permeten estudiar molècules en dissolució) parlarem del dicroïsme circular i dels infrarojos, i dins les tècniques d’alta resolució ens centrarem en les raigs X i la RMN. La difracció de raigs X és un mètode molt potent per determinar els detalls de l’estructura 3D de les proteïnes globulars i d’altres però presenta una limitació fonamental i és que només es pot utilitzar quan les molècules han cristalitzat i això no sempre és fàcil o possible.

17 Cristal·lografia de raigs XTÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURA Les tècniques més conegudes i amb més resolució són: Tècnica Avantatges Inconvenients RMN Alta resolució Molt costós econòmicament Molt temps Molt complex Només molècules petites Cristal·lografia de raigs X Només molècules cristal·litzades Les tècniques més conegudes i amb més resolució són la cristal·lografia de raig X i la ressonància magnètica nuclear. Aquestes tècniques però, són molt sofisticades i costoses tant en temps com en diners. Per aquest motiu ens plantegem estudiar altres tècniques que permetin fer una reconstrucció estructural de les proteïnes de forma més ràpida. Pel que fa a la interacció, es podira mirar amb RMN fent un anàlisi amb deuteri al medi, ja que els protons de la interacció no queden deuterats.

18 Absorció preferencialTÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURA DICROÏSME CIRCULAR Dicroïsme circular Llum polaritzada circularment a la dreta Llum polaritzada circularment a l’esquerra Polarització de la llum: Polarització plana Polarització circular Ara passarem a parlar de les tècniques espectroscòpiques que ens permetran conèixer l’estructura secundària de la proteïna ja que ens donen el percentatge de hèlix alfa i fulles beta. La llum pot polaritzar-se de diverses formes. La més coneguda és la polarització plana , en la que el camp elèctric de la variable de la radiació té una oritentació fixa i per tant les ones vibren en un sol pla. Una altra forma de polarització és la polarització circular, en la que la direcció de polarització rota amb la freqüència de la radiació. Si s’observa un feix polaritzat circularment que se li apropa, el camp elèctric pot estar rotant tant en el sentit de les agulles del rellotge com en el contrari. La primera es denomina llum polaritzada circularment cap a la dreta, i la segona llum polaritzada circularment cap a l’esquerra. La majoria de molècules que s’estudien són assimètriques. Aquestes molècules presenten una preferència per l’absorció de llum polaritzada circularment cap a l’esquerra o cap a la dreta. Així, per exemple, un feix polaritzat circularment cap a la dreta interactua de forma diferent front a una hèlix alfa a dretes que un feix polaritzat circularment cap a l’esquerra. Aquesta diferència d’absorció denominada dicroïsme circular es defineix com : ΔA= AL – AR / A On AL és l’absorbància de llum polaritzada circularment cap a l’esquerra i Ar a la dreta. A és l’absorbància per la llum no polaritzada. Donat que l’increment de A pot ser positiu o negatiu, un espectre de dicroïsme circular és diferent d’un espectre d’absorció normal en el que es permeten els valors + i - . Absorció preferencial ΔA= AL – AR / A Espectre DC característic

19 ESPECTROSCOPIA D’INFRAROJOS (I)TÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURA ESPECTROSCOPIA D’INFRAROJOS (I) Les molècules no són estàtiques: tenen freqüències en les que roten i vibren Molècules complexes  absorcions en l’infraroig relacionades amb grups químics Els àtoms d’un grup CH2 poden vibrar de 6 maneres diferents Absorcions d’enllaços en molècules orgàniques symmetric asymmetric twisting rocking scissoring wagging La espectroscopia infrarroja se basa en el hecho de que las moléculas tienen frecuencias a las cuales rotan y vibran, es decir, los movimientos de rotación y vibración moleculares tienen niveles de energía discretos (modos normales vibracionales). Las moléculas diatómicas simples tienen solamente un enlace, el cual se puede estirar. Moléculas más complejas pueden tener muchos enlaces, y las vibraciones pueden ser conjugadas, llevando a absorciones en el infrarrojo a frecuencias características que pueden relacionarse a grupos químicos. Los átomos en un grupo CH2, encontrado comúnmente en compuestos orgánicos pueden vibrar de seis formas distintas, estiramientos simétricos y asimétricos, flexiones simétricas y asimétricas en el plano (scissoring y rocking, respectivamente), y flexiones simétricas y asimétricas fuera del plano (wagging y twisting, respectivamente); como se muestra a continuación

20 TÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURAESPECTROSCOPIA D’INFRAROJOS (II) Les proteïnes no són estàtiques: tenen freqüències en les que roten i vibren L’IR travessa la mostra i es registra l’E absorvida a cada longitud d’ona  transició entre dos nivells d’energia vibracional Espectre d’absorvància: longituds d’ona en que la mostra absorveix l’IR  interpretació dels enllaços presents Només funciona per enllaços covalents PROTEÏNES Un cop explicada la teoria general de l’espectroscopia d’infraroigs, en centrarem en la seva utilitat en el món de les proteïnes. Per tant, el que hem aplicat a les molècules en general també passa en les proteïnes, és a dir, les proteïnes roten i vibren. Para medir una muestra, un rayo de luz infrarroja atraviesa la muestra, y se registra la cantidad de energía absorbida en cada longitud de onda, lo cual hace posible la transición entre dos niveles vibracionales de energia diferentes. Se puede trazar un espectro de transmitancia o absorbancia, el cual muestra a cuales longitudes de onda la muestra absorbe el IR, y permite una interpretación de cuales enlaces están presentes. Les proteïnes presenten múltiples tipus de vibracions i múltiples tipus d’oscil·lacions, els quals són característics de cada tipus d’estructura secundària. Múltiples vibracions Múltiples oscil·lacions Estructura secundària

21 Cristal·lografia de raigs X Espectroscopia d’infrarrojosTÈCNIQUES PER DETERMINAR L’ESTRUCTURA RMN RMN Cristal·lografia de raigs X Espectroscopia d’infrarrojos Dicroïsme circular Mètodes computacionals Les tècniques que acabem de comentar, a part dels inconvenients que hem explicat, se’ns presenta el fet que no teinm els recursos necessaris per dur-les a terme. Per tant, el modelatge de l’estructura del TGN1412 l’hem fet a partir de mètodes computacionals.

22 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412Obtenció de la seqüència del TGN1412 a partir de la patent US - Donar els permisos $ source /cursos/BE/programari/bashrc_aules PSI-BLAST  No hits significatius $ blastpgp –i seqVL.fa –d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas –C seqVL_sprot.pssm –j 10 –o seqVL_sprot.out $ blastpgp –i seqVL.fa –d /cursos/BE/databases/blastdat/pdb_seq –j 1 –R seqVL_sprot.pssm –o seqVL_sprot_pdb.out Vam buscar la patent del TGN i vam veure que tenia dues cadenes que vam decidir modelar per separat. Per fer el model vam intentar trobar el màxim de templates amb un Psi-Blast ,però no vam trobar cap hit significatiu. Per això, ens vam fixar en el seu receptor (CD28) que vam buscar al pdb i vam trobar un CD28 humà interaccionant amb una immunoglobulina (1yjd) que vam utilitzar com a motlle per modelar al TGN1412.

23 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412Obtenció del template a la web del pdb $ /cursos/BE/programari/PERL/PDBtoSplitChain.pl -i pdb1YJD.ent -o 1YJD - Alineament contra 1YJD_L (CD28+part variable d’una IgG) $ cat *.fa > totes.fa $ clustalw totes.fa

24 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412 MODELLER$ aconvert –in c –out p totes.pir $ gedit totes.py

25 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412Executem el Modeller $ source /cursos/BE/programari/bashrc_novell $ mod9v7 totes.py - Canviem els noms dels models $ mv seqVL.B pdb modelo1.pdb $ mv seqVL.B pdb modelo2.pdb Creem el fitxer.domain Vam fem un modeler per després poder fer un stamp amb els dos models obtinguts.

26 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412 STAMP$ stamp – fitxer.domain –rough –n 2 –prefix motlles > motlles.out - TRANSFORM $ transform –f motlles.2 –g –o motlles2_stamp.pdb Veiem que obtenim un RMSD de 0,17. Per tant, com que és un valor menor de 2 considerem que és una bona superposició, és a dir, que les estructures són semblants. Si el valor fos entre 2 i 4 dubtaríem i si fos superior a 4 consideraríem que la sobreposició és incorrecta o que les estructures són diferents.

27 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412AVALUACIÓ AMB PROSA  SESSIÓ 1 $ prosa read pdb model1.pdb model1 read pdb model2.pdb model2 analyze energy * color * model1 yellow color * model2 green winsize * 30 plot model1, model2 Com veiem les energies dels dos models són molt semblants, i són totes negatives. Observem un pic que es troba per sobre de 0 i vam pensar que podria ser degut a la falta d’interacció amb l’altra cadena. Per tant, vam separar l’energia combinada en les 3 energies corresponents.

28 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412 Comb surf pairPodem veure que el pic positiu correspon a l’energia de superfície, per tant, tal com havíem pensat, el pic segurament és degut a la falta d’interacció amb l’altra cadena. Magenta = surface Cyan = combinada Yellow = pair (la de dins??)

29 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412- AVALUACIÓ AMB PROSA  SESSIÓ 4b $ prosa read pdb model1.pdb model1 read pdb model2.pdb model2 init zscore combine type sdev zscore model1 z - result sorted_depth = 0 Zzscore model2 z - result L’energia combinada no entra dins el rang, però ja és normal perquè falta fer la interacció amb la cadena pesada.

30 Model TGN1412 - VMD

31 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA LLEUGERA TGN1412 ProcheckUn cop escollit el model avaluem amb el programa procheck. Aquest programa ens avalua les estructures estereoquimicament (analitza l’estructura general i residu per residu). Procheck ens proporciona ramachandran plot on s’observa la disposició de les estructures secundàries del model obtingut. A més, ens proporciona el procheck summary on ens fixem en el % del core i allow, i en els bad contacts i cis-peptids que han de ser valors baixos. Procheck genera un fitxer.sum. És un resum numèric del mapa de ramachandran. Veiem els percentatges de residus a cada zona. Podem trobar 4 tipus de zona: - core - allow - gener - disall El core és on el percentatge hauria de ser meś gran, és la zona que veiem vermella del mapa de ramachandran L'allow són combinacions una mica menys estables però encara permeses, i correspon a la zona groga del mapa de ramachandran. Generously allowed ja no són gaire estable, tot i que encara estarien "generosament" permeses. Són les que veiem de color crema al mapa. Disall, són les combinacions prohibides, i al mapa les veiem blanques. Per tant, com més gran sigui el percentatge del core i l'allow i més baix el gener i el disall millor. A més, el fitxer sum també ens informa dels bad contacts, que són àtoms ques estan massa junts i xoquen (ja que la distància és menor que la suma dels radis de van der waals). Com menys bad contacts tingui també millor. Mapa ramachandran: Permet visualitzar totes les combinacions possibles dels angles dihèdrics psi i phi dels aminoàcids d'un polipèptid Al quadrant de dalt a l'esquerre podem veure les combinacions de fulla beta, mentre que el quadrant de baix a l'esquerre i de dalt a la dreta hi ha les combinacions beta.

32 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA PESADA TGN1412Es van seguir els mateixos passos que els descrits per la cadena lleugera La regió de la dreta (dos fulles beta) no és la que interaccionas amb el receptor,.

33 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA PESADA TGN1412Avaluació amb PROSA Model 1 yellow, model 2 green. Ens quedem amb el model 2 perquè l’energia és més baixa que en el model1. model1, model2

34 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA PESADA TGN1412 Comb surf pairEl valor del z score combinat el trobem dins del rang .?¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿¿ Podem veure que el pic positiu correspon a l’energia de superfície, per tant, segurament és degut a la falta d’interacció amb l’altra cadena. Magenta = surface Cyan = combinada Yellow =p air

35 Model TGN1412 FRACCIÓ VARIABLE CADENA PESADA TGN1412 Procheck(no cal tornar-ho a explicar, només comentar els números!) Un cop escollit el model avaluem amb el programa procheck. Aquest programa ens avalua les estructures estereoquimicament (analitza l’estructura general i residu per residu). Procheck ens proporciona ramachandran plot on s’observa la disposició de les estructures secundàries del model obtingut. A més, ens proporciona el procheck summary on ens fixem en el % del core i allow, i en els bad contacts i cis-peptids que han de ser valors baixos. Procheck genera un fitxer.sum. És un resum numèric del mapa de ramachandran. Veiem els percentatges de residus a cada zona. Podem trobar 4 tipus de zona: - core - allow - gener - disall El core és on el percentatge hauria de ser meś gran, és la zona que veiem vermella del mapa de ramachandran L'allow són combinacions una mica menys estables però encara permeses, i correspon a la zona groga del mapa de ramachandran. Generously allowed ja no són gaire estable, tot i que encara estarien "generosament" permeses. Són les que veiem de color crema al mapa. Disall, són les combinacions prohibides, i al mapa les veiem blanques. Per tant, com més gran sigui el percentatge del core i l'allow i més baix el gener i el disall millor. A més, el fitxer sum també ens informa dels bad contacts, que són àtoms ques estan massa junts i xoquen (ja que la distància és menor que la suma dels radis de van der waals). Com menys bad contacts tingui també millor. Mapa ramachandran: Permet visualitzar totes les combinacions possibles dels angles dihèdrics psi i phi dels aminoàcids d'un polipèptid Al quadrant de dalt a l'esquerre podem veure les combinacions de fulla beta, mentre que el quadrant de baix a l'esquerre i de dalt a la dreta hi ha les combinacions beta.

36 Model TGN1412 FRACCIONS VARIABLES CADENA LLEUGERA + CADENA PESADAUna vegada modelades les dues cadenes mitjançant stamp vam aconseguir ajuntar les cadenes i ens vam assegurar que estigués orientat a l’espai igual que estava la Ig del pdb 1YJD. Una vegada tenim el TGN modelat, ens interessa tenir-lo amb la interacció amb el CD28 humà, per tal de poder comparar les dues interaccions (TGN-murí vs TGN-humà) Per tant, vam procedir a modelar el CD28 murí, ja que el cd28 humà està modelat a internet. Però abans, ens va interessar fixar-nos en l’estructura de les proteïnes involucrades en la nostra recerca. Com que sabem que totes són immunoglobulin-like ens centrarem en aquest tipus de plegament. Una vegada vam modelar les cadenes lleugera i pesada per separat vam haver d’unir-les en la seva conformació normal per poder posteriorment modelar les interaccions amb els receptors. Ho vam fer usant Stamp amb els models de les cadenes lleugera i pesada per separat contra el pdb 1YJD, per assegurant-se que les cadenes ens quedessin orientades tal i com haurien d’interaccionar amb el receptor. En primer lloc vam fer un Stamp de la cadena lleugera contra 1YJD de manera que vam superposar la LC amb la LC del superantígen cristal·litzat amb 1YJD. Vam fer el mateix amb la cadena pesada. Per últim vam eliminar 1YJD del pdb final i vam unir per mitjà de la comanda cat les dues cadenes (LC i HC). Aquesta és la imatge del TGN final. Hi ha una part de la cadena pesada que no se’ns ha modelar gaire bé, però no li vam donar gaire importància ja que no es tracte de la part amb la que interacciona.

37 Plegament Ig-like Classe: tot βPlegament: Immunoglobulin-like β sandwich Superfamília: Immunoglobulin Dominis V set: antibody variable domain-like  antigen binding Dominis C1 set: antibody constant domain-like  funcions efectores Dominis C2 set: domini intermig entre V i C1 Dominis I set Les immunoglobulines pertanyen a la classe tot β, és a dir, estan compostes majoritàriament de fulles β. Tenen un plegament Immunoglobulin-like β sandwich i pertanyen a la superfamília de les immunoglobulines. En la família de les immunoglobulines es poden distingir clarament dos dominis: V i C. La majoria de dominis Ig pertanyen a una d’aquestes cateogires. Els V-set són variables i són responsables de les propietats d’unió a l’antigen. Per tant, s’hi classifiquen els dominis variables de les cadenes pesades i lleugeres i els Rc CD28 i CTLA4 (ho veurem més endavant). Els dominis IgV tenen 9 cadenes beta. Els dominis C-set són responsables de mediar les funcions efectores. Els dominis C-set es diferencien perquè són més curts i no tenen les cadenes C’ i C’’. Per tant, només tenen 7cadenes. Hi trobarem els dominis constants de les cadenes pesades i lleugeres. Posteriorment, a mida que es van anar seqüenciant més proteïnes de la família de les Igs, es va diferenciar entre el domini C1 i C2. En el domini C1 hi ha els dominis trobats exclusivament en les Igs, antigens MHC i β microglobulines es van incloure dins el domini C1. En el domini C2 s’hi van classificar un conjunt de noves proteïnes amb dominis similars al V, però de la mateixa mida que els C. Posteriorment, com que es va trobar més variabilitat en els dominis es va establir un nou conjunt de dominis anomenat I-set. En què s’inclouen dominis intermediaris. Els dominis exteriors dels FcR gamma són d’aquesta categoria. La majoria de proteïnes que es troben a la superfície de la membrana dels leucòcits contenen tant sols dos dominis. EXPLICAR EL V I C1 I ELS ALTRES DOS COMENTAR QUE SON INTERMIT.

38 Plegament Ig-like Plegament: Immunoglobulin-like β sandwichA la imatge es pot veure el típic plegament Ig. Les cadenes beta es representen com a bandes amples, i els loops que les uneixen com a tubs més prims. A la dreta hi ha la visió esquemàtica. Es poden veure les dues fulles beta antiparal·leles. Les interaccins es dónene entre els aminoàcids hidrofòbics conservats de la part interior del sandwitch. Els dominis C es diferencien perquè les cadenes C’ i C’’ no hi són. La llargada de les cadenes i els loops pot variar considerablament entre proteïnes. També es pot veure la posició del pont disulfur conservat, indicat amb SS entre les cadenes B i F, que estabilitza el plegament. Els dominis Ig es caracteritzen per un pont disulfur conservat entre les dues fulles beta. Les immunoglobulines (aquí vull dir la proteïna completa), a més, tenen altre ponts disulfur entre les cadenes pesades i entre la cadena pesada i la lleugera.

39 Plegament Ig-like Plegament: Immunoglobulin-like β sandwich

40 Interacció TGN1412 + CD28 humàModel sense optimitzar: Extreure el CD28 del PDB 1YJD: $ /cursos/BE/programari/PERL/PDBtoSplitChain.pl -i 1YJD.pdb -o 1YJD Per unir els 2 fitxers usarem la comanda cat: $ cat 1YJDC.pdb > TGN_CD28huma.pdb $ cat TGN_todo >> TGN_CD28huma.pdb Una vegada tenim el TGN modelat, ens interessa tenir-lo amb la interacció amb el CD28 humà, per tal de poder comparar les dues interaccions (TGN-murí vs TGN-humà) Per tant, vam procedir a modelar el CD28 murí, ja que el cd28 humà està modelat a internet. Ara volem analitzar les interaccions que hi ha entre el CD28 humài el TGN1412 (TGN-murí vs TGN-humà). Per poder-ho fer necessitem tenir-los en un mateix fitxer. Per això podem usar la comanda cat i unir dos pdb’s: Un que conté les dues cadenes de TGN1412 Un altre que conté el CD28 humà. Aquest pdb l’hem obtingut mitjançant el PERL pdb to Split Chain del pdb original (1YJD)  dels pdb que se’ns creen ens hem de quedar amb el que es diu 1YJDC. Després fem cat dels dos arxius i ens queda així. Ara s’ha optimitzar aquest model. Per fer-ho podem usar el programa VMD. Primer crearem el PSF de la molecula que ens permetrà tenir les energies del model. Després solvatarem el TGN_CD28huma i finalment optimitzarem usant NAMD. FALTA LA MOLECULA SOLVATADA BEN CREADA.

41 Interacció TGN1412 + CD28 humà- Optimització de la interacció

42 Interacció TGN1412 + CD28 humà- NAMD ALL Mitjançant el VMD hem analitzat l’energia NAMD. A la diapositiva veiem les energies de tot el complex junt (aigua + protein) i de la proteïna i l’aigua per separat. Si ens fixem en l’energia total (línia negre) dels 3 gràfics veiem que amb la optimització l’energia total ha disminuït. Per tant, és una evidència de que la optimització ha funcionat. PROTEIN WATER

43 Model CD28 murí Obtenció de la seqüència del CD28 murí a swissprot (P10747) Psi-blast: - Obtenció del template a la web del pdb ClustalW Com que sabem que l’estructura està més conservada que la seqüència, tot i saber que la seqüència d’unió a l’anticòs que veiem al cd28 humà no es troba al cd28 murí, vam voler comprovar que les estructures també eren diferents . Per a que una interacció es doni, necessitem que el loop sigui igual en cd28 humà i murí (ja que alguns aminoàcids tenen propietats redundants) Vem fer el psi-blast x trobar homòlegs i vam trobar el tamplate 1yjd_c (que havíem estat utilitzant fins ara). Vam alinear la seqüència de cd28 murí i el template trobat- en vermell, la zona que interacciona amb el TGN1412.

44 Model CD28 murí Aconvert  obtenció del fitxer.pir Crear el fitxer.pyModeller  obtenció dels models Stamp Transform Rasmol RMS : Veiem que obtenim un RMSD de 0,17. Per tant, com que és un valor menor de 2 considerem que és una bona superposició, és a dir, que les estructures són semblants. Si el valor fos entre 2 i 4 dubtaríem i si fos superior a 4 consideraríem que la sobreposició és incorrecta o que les estructures són diferents.

45 Model CD28 murí Avaluació amb PROSAVeiem dos prosas, el de l’esquerra conté el model 1 i 2 obtinguts i el template amb el que hem modelat. En aquest veiem un pic d'energia en els nostres models que no observem al template. Això ho podem observar ja que hem modelat a partir d’una interacció, motiu pel qual realitzem l’altre prosa per analitzar les diferents energies del model escollit. Així comprovem que el pic és degut a l’energia de superfície. Mod1 mod2 1YJD Comb surf pair

46 Model CD28 murí Procheck Un cop escollit el model avaluem amb el programa procheck. Aquest programa ens avalua les estructures estereoquimicament (analitza l’estructura general i residu per residu). Procheck ens proporciona ramachandran plot on s’observa la disposició de les estructures secundàries del model obtingut. A més, ens proporciona el procheck summary on ens fixem en el % del core i allow, i en els bad contacts i cis-peptids que han de ser valors baixos.

47 Interacció TGN1412 + CD28 muríModel sense optimitzar:

48 Interacció TGN1412 + CD28 muríModel optimitzat: Per optimitzar el model hem solvatat la molècula i posteriorment, usant Namd2.exe hem obtingut la molècula optimitzada. Vam optimitzar la molècula mitjanant una solvatació dins d’una esfera d’aigua. Al solvatar la molècula es relaxa i el aa de la superfície s'estabilitzen. Portem a la molècula al seu mínim energètic.

49 Interacció TGN1412 + CD28 murí- NAMD ALL Mitjançant el VMD hem analitzat l’energia del model optimitzar mitjançant NAMD. A la diapositiva veiem les energies de tot el complex junt (aigua + protein) i de la proteïna i l’aigua per separat. Si ens fixem en l’energia total (línia negre) dels 3 gràfics veiem que amb la optimització l’energia total ha disminuït. Per tant, és una evidència de que la optimització ha funcionat. FALTA COMPARAR AMB LES ENERGIES DEL MODEL SENSE OPTIMITZAR PROTEIN WATER

50 Comparació de les interaccionsPISA: Interacció TGN1412 CD28 humà sense optimitzar Mirem mitjançant el programa on-line PISA les interaccions que apareixen entre CD28 humá i TGN sense optimitzar la interacció. Chain A TGN, Chain D CD28. L’energia de la interacció (AG) no es gaire negativa. Veiem que ens apareixen molt ponts d’H però cap salí, ni disulfur ni covalent. Les distàncies dels ponts d’H hauríen d’estar al voltant de 2,6. Veiem que en tenim un quants . El que farém ara es veure com varien auqetses interaccions quan optimitzem el model. Veiem que la interacció no es massa bona, que no es el que nosaltres esperaríem. Per mirar on estar l’error, enviem a PISA el pdb 1YJD (el que hem utilitzat com a template) INTERPRETAR DIFERÈNCIES Com som conscients que tenim problemes en el nostre model CD28 humà –TGN i si l’utilitsezim per analitzar els resultats dels altres models hauríem de prendre com a bones hipòtesis que sabem per altres comprovacions que no ho son, ens fixarem en les interaccions que apareixen en el pdb 1YJD per comparar amb les altres interaccions.

51 Comparació de les interaccionsPISA: Interacció TGN1412 CD28 humà optimitzat Al optimitzar hauria d’haver millorat la interacció, ja que estem segur que aquestes dos proteines interaccionen. Considerem normal que apareguin menys ponts d’H ja que els inespecífics desapareixen, però els que ens quedessin hauríen de ser mes curts, és a dir, més forts, i el que veiem es que només en tenim un de 2.68 i un altre de molt llarg. A més a més, la AG és més possitiva. Això no és el que esperavem, per tant, per intentar identificar l’error i vuere si era posa el que fallava, vam fer pisa del 1YJD ja que aquesta interacció sí que succeeix segur i estar cristalitzada.

52 Comparació de les interaccions

53 Comparació de les interaccionsPISA: Interacció 1YJD En la interacció que està cristalografiada es veu que es bona, ja que tenim un score de la interacció de 1.00 i un AG de -23, molts ponts d’hidrògen molt curts 2 dos ponts iònics. Veient els resultats, estem gairabé egur que tenim algún error en el nostre model TGN –CD28 que no hem sigut capaces de identificar. Per no arrosegar els errors a les demés hipòtesis i no haver d’acceptar hipòtesis que hem descartat mitjanzant altres`anàlisis, compararem les interacció del 1YJD amb les interaccions dels nostres models hipòtesis.

54 Comparació de les interaccionsPISA: Interacció TGN1412- CD28murí del model optimitzat Veiem que la AG és gairabé positiva (-1.2) i que només hi ha un pont d’H. Per tant, tornem a refutar la hipótesis.

55 Comparació de les interaccions

56 HIPÒTESIS Alineament CD28 humà vs CD28 macacFent l’alineament entre cd28 humà i cd28 macac veiem que la seqüència de la zona d’interacció del cd28 amb el TGN és igual. Per tant, hem de refutar la hipòtesi de que les diferències en els efectes són degudes a diferències en la seqüència d’interacció. No obstant, també hi podrien haver diferències en la interacció degut a canvis en residus veïns a la zona d’interacció, però observem que gairebé tota la seqüència és igual. Canvis entre els cd28 estan a al zona transmemrana i poden afectar a la cascada de senyalització intracel·lular però no en la interacció. La hipòtesi queda refutada, per tant, no repetim el procés anterior. Seqüències iguals  Efectes diferents Refutem la hipòtesi

57 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

58 HIPÒTESI 2 2a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a diferències en la concentració de CD28 en humà vs macac Concentracions iguals Refutem la hipòtesi Efectes diferents Ens vam plantejar una segona hipòtesi en la que creiem que potser els diferents efectes eren deguts a concentracions diferents de CD28 en humà respecte macac. Potser en humà hi havia molts més receptors i això podia ser la causa de que els efectes fossin molt més grans. Consultant a la bibliografia vam veure que macac i humà tenen pràcticament la mateixa concentració de CD28, per tant, els efectes diferents no poden ser deguts a això. Schraben B, Kalinke U. CD28 superagonists: What Make the Difference in Humans. Immunity. 2008;

59 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant de TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

60 HIPÒTESI 3 3a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a diferències en l’afinitat del TGN1412 per CD28 humà vs macac Ens vam plantejar una tercera hipòtesi en la que creiem que els efectes diferents potser eren deguts a que, tot i haver-hi la mateixa concentració de receptors en humà que en macac, l’afinitat del TGN pel receptor CD28 podia ser diferents en les dues espècies. No obstant, consultant a la bibliografia vam veure que les afinitats eren iguals, per tant, novament refutem la hipòtesi. Hanke T. Lessons from TGN1412. The Lancet. 2006; 368: Schraben B, Kalinke U. CD28 superagonists: What Make the Difference in Humans. Immunity. 2008;

61 HIPÒTESI 3 3a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a diferències en l’afinitat del TGN1412 per CD28 humà vs macac Afinitats iguals Refutem la hipòtesi Efectes diferents

62 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

63 HIPÒTESI 4 4a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a una possible interacció del TGN1412 amb un paràleg de CD28 Pot ser que els efectes secundaris del TGN provinguin d’una interacció no predita del TGN amb un homòleg. El TGN1412 pot ser que s’uneixi per una altra regió al CTLA4. No es va poder predir aquesta interacció ja que els animals amb els que es va testar el TGN no tenen aquest homòleg o és diferent.

64 PARÀLEG CD28 Busquem al Swisprot homòlegs de CD28:Només ens interessen els hits d’humà, ja que busquem paràlegs. Busacamos en Swisprote porque contiene más proteíans- Vemos que hay un parálogo humano, ahora necesitamos saber qué funciones tiene y cómo afecta al sistema inmunitario para saber si coincide con los efectos sufridos por los pacientes.

65 PARÀLEG CD28 CTLA-4 Similar a la proteïna CD28.Regulació negativa de l’activació dels limfòcits. 20 vegades més afinitat amb el CD80 i CD85. Senyals inhibitoris a les cèl·lules T. Acció contrària a CD28: apoptosi i anèrgia en cèl. T activades Fig. 2 B7 ligation of CTLA-4 (a) triggers apoptosis or energy in T cell populations. Inhibition of CTLA-4 signalling (b) prevents apoptosis/anergy in the activated T cell population Buscamos información bibliográfica de CTLA4 para saber que funcion stine y poder saber si los efectos adversos de los pacientes pueden ser debidos a la activación de este. CTLA-4 (Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4), miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es la principal molécula inhibidora implicada en la regulación negativa de la activación de los linfocitos. Es similar a la proteina CD28, y las dos moléculas interaccionan con CD80 y CD85 de la células presentadoras de antígenos (20 veces más afinidad que CD28) . CTLA4 transmite señales inhibitorios a las céluas T, y al contrario que el CD28, provoca anergia y la apoptosis (Anergia es un estado de los linfocitos en el cual éstos, pese a estar presentes, no son activos) La hipótesis sigue siendo válida, ya que los efectos coinciden con su función.

66 PARÀLEG CD28 Comparació entre la seqüència de CD28 i CTLA 4Comparem les seqüències dels 2 per veure si hi ha diferències en el lloc d’unió al lligant. Si fossin iguals, el TGN es podria haver unit també al CTLA4, però podem veure que a nivell de seqüència són diferents. La seqüència d’unió al superagonista és diferents. Aunque la secuencia es distinta, puede ser que la estructura sea parecida y pueda haber una unión, para eso comparamos las dos estructuras. 2X44D correspón a CTLA4 humà.

67 PARÀLEG CD28 Comparació entre l’estructura de CD28 i CTLA 4 CTLA-4Comparem amb un STAMP l’estructura dels dos receptors. Veiem que el loop d’unió al superagonista es diferent. Está pintat de groc i verd a la imatge. (aa 60-65) Ara sabem que les estructures són diferentes, però ens falta comprobar per descartar la hiòtesis que la interacció amb el TGN no sigui possible amb aquest loop.

68 PARÀLEG CD28 Model de la interacció CTLA4 –TGN1412Modelem una posible interacció entre CTLA4 TGN. Com suposem que CTLA4 interaccionrà pel mateix lloc que ho feia CD28 amb TGN, fem mitjançant STAMP contra el pdb en el que teniem 1YJDC (només conté la part del CD28), i posterioprment fem un cat per adjuntar al pdb la estructura del TGN en la orientació que tenia en el pdb de la interacció TGN-CD28. Al final optimitzem la interacció i obtenim aquest model.

69 PARÀLEG CD28 NAMD WATER ALL PROTEIN

70 PARÀLEG CD28 Comprovació de la optimització original optimitzatVeiem una altre vegada que al optimitzar disminueixen els bad contacts. FALTA FORMATOOOOO!!!!

71 PARÀLEG CD28 PISA: Interacció entre CTLA4 –TGN1412Mirem la possible inteacció CTLA4-TGN i veiem que la AG es positiva (+1) i per tant podem afirmar que aquesta interacció no es produeix i descartar la hipòtesis.

72 PARÀLEG CD28 Busquem en VMD les interaccions que ens ha donar PISA i comprobem que es donen de veritat i que són possibles les interaccions. Les distàncies, encara que no exactes, tmb es correlacionen.

73 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

74 HIPÒTESI 5 5a hipòtesi: Els diferents efectes poden ser deguts a una interacció del TGN1412 amb ell mateix, pel fet de ser una proteïna immunoglobulin-like. - Predicció de la possible interacció TGN –TGN Tal com hem comentat abans, el TGN1412 és una proteïna amb plegament immunoglobulin-like i interacciona amb el cd28, que té el mateix plegament. Per tant, se’ns va acudir que el TGN1412 possiblement pot interaccionar amb ell mateix. Ara bé, hem de tenir en compte que si això fos possible també hagués pogut passar amb macacs. Aleshores, el primer que vam fer va ser veure si el TGN és possible que interaccioni amb ell mateix. Si ho és, llavors els efectes diferents en humà i macac poden ser deguts a que els macacs responguessin diferent als agregats del TGN1412, però això ja no ho hem pogut estudiar. Per fer pydock vam crear un pdb donant com a receptor i lligand la part variable del TGN i la part constant del TGN. El pydock ens ha calculat totes les possibilitats d’interacció entre Fc del TGN i la regió variable del TGN. El programa també et dóna un rang de les conformacions tenint en compte les diferents energies: electrostàctica, de desolvatació i dels enllaços de VDW. La millor conformació (posició 1 del rànquing) és la 360. Aquesta és la que escollim i amb la que treballarem a partir d’ara.

75 Docking TGN1412 + TGN1412 $ ssh [email protected]$ source /cursos/BE/programari/bashrc_luke Crear fitxer.ini $ pydock fitxer setup Crear un fitxer amb la comanda ftdock enviar.txt Enviar el fitxer a la cua: $ qsub enviar.txt Output generat: fitxer.ftdock Editar el fitxer enviar.txt  comanda rotzdock Output generat: fitxer.rot Editar el fitxer enviar.txt  comanda dockser Output generat: fitxer.ene Creem un fitxer amb totes les comandes que ens serviran per enviar els fitxers a la cua i poder continuar treballant (enviar.txt) L’output que ens crea és fitxer.zdock Ara per fer el següent pas hem d’editar el fitxer enviar.txt i canviar la comanda ftdock per rotzdock Ara si que ja podem enviar el fitxer a la cua. L’output generat serà fitxer.rot. Tornem a obrir amb l’emacs enviar.txt i canviem la comanda rotzdock per dockser: l’output ja és fitxer.ene Nota per nosaltres: Per copiar un fitxer del nostre directori a internet hem de fer l’ordre: scp fitxer

76 Docking TGN1412 + TGN1412 Predir la interfície d’interacció: ODAEditar el fitxer enviar.txt  comanda oda Enviar el fitxer a la cua: $ qsub enviar.txt Output generat: fitxer.pdb.oda Avalua la superfície òptima de docking a partir de l’energia de dessolvatació. Oda permet avaluar la superfície òptima de docking (oda) a la partir de l’E de dessolvatació. En el fitxer.pdb tindrem la info guaradad en la columna del B-factor. Com que dóna més informació el NIP no mirem el fitxer amb VMD, sinó que passem directament a executar el NIP i això sí que ho mirarem amb VMD.

77 Docking TGN1412 + TGN1412 Predir la interfície d’interacció: NIPEditar el fitxer enviar.txt  comanda patch Enviar el fitxer a la cua: $ qsub enviar.txt Output generat: fitxer.pdb.nip Valors de NIP (probabilitat d’estar a la interfície): NIP = 0  igual que a l’atzar NIP < 0  Menor que a l’atzar NIP > 0.4  Major que a l’atzar NIP, a partir de les 100 millors solucions del ranking pydock podem trobar la regió consens d’interacció fent la comanda PATCH. El resultat és una sèrie de fitxers amb la info dels residus amb la seva NIP (normalized interface property), així com el mateix valor en forma de columna de B-factors en fitxers PDB. Nota per nosaltres: Per obrir un fitxer d’internet amb el vmd primer hem de passar el fitxer a l’ordniador. Això ho fem amb dues ordres possibles: scp  scp  /home/u41194.est12.alu.upf/novell/home/directori_de_treball

78 Interacció TGN-TGN - Predir quina seria la possible interacció TGN –TGN amb PyDock pydock import pyDockMakePDB pyDockMakePDB.main (fitxer,X,X) Optimitzat Abans d’optimitzar A partir de l’output generat pel pydock creem la imatge de la interacció amb el VMD. A més, aquest programa ens permet optimitzar la interacció, que observem amb VMD a la imatge de la dreta. La imatge correspon a l’últim dels 100 frames que hem generat (com que el procés és iteratiu, l’últim model representa que és el millor). Per tal d’estar segurs que el model optimitzar realment ha millorat respecte l’inicial, decidim avaluar el model optimitzat mitjançant, procheck, prosa i pisa.

79 Interacció TGN-TGN - NAMD PROTEIN ALL WATERMitjançant el VMD hem analitzat l’energia NAMD. A la diapositiva veiem les energies de tot el complex junt (aigua + protein) i de la proteïna i l’aigua per separat. Si ens fixem en l’energia total (línia negre) dels 3 gràfics veiem que amb la optimització l’energia total ha disminuït. Per tant, és una evidència de que la optimització ha funcionat. ALL WATER

80 Interacció TGN-TGN - Optimització de la interaccióDesprés d’optimitzar el model d’interacció entre TGN-TGN per tal d’avaluar-lo estereoquímicament amb el procheck prèviament hem fet un PDBsplitToChain per separar les dos molècules ja que el docking ens les ha unit en un mateix document com si fóssin una de sola. Un cop les tenim separades en cadena A i B concatenem els arxius en un fitxer nou, el qual utilitzarem en procheck. Els resultats obtinguts són els següents: Observem que la suma del core i l’allow és major de 99 i per tant, és correcte. [llegir diapo primera ramachandran] Pel que fa als bad contacts observem que n’hi ha una gran quantitat i per tant, no podem assegurar que la interacció sigui possible.

81 Interacció TGN-TGN PISA: Interacció TGN1412-TGN1412B : part variable del TGN i A: part constant TGN. El pisa ens dóna com a resultat que hi poden haver 12 ponts d’hidrogen entre les dues cadenes.

82 Interacció TGN-TGN Ponts d’hidrogenPer tal de comprovar les interaccions, hem utilitzat el VMD per visualitzar les interaccions entre els aminoàcids i així podem calcular quina és la distància d’interacció entre ells i veure així si coincideix. El que veiem és que les interaccions són de menor distància que el que indicaven els resultats del pisa, per tant, corroborem els resultats del pisa.

83 Interacció TGN-TGN Ponts d’hidrogen

84 Interacció TGN-TGN PISA: Interacció TGN1412-TGN1412En aquest cas observem també la formació de dos enllaços iònics.

85 Interacció TGN-TGN Enllaços iònics

86 Interacció TGN-TGN Existència de ponts d’hidrogen i d’enllaços iònics suficient? I en macacs? En macacs també s’haguessin pogut formar agregats TGN-TGN, per tant, refutaríem la hipòtesi Caldria estudiar si els humans responen diferent als agregats TGN-TGN respecte els macacs possible nova hipòtesi Amb els resultats obtinguts no podem assegurar que la interacció descrita sigui realment possible. Ara bé, si fos possible no podem dir si els efectes diferents en macac i humà són deguts a això ja que en macac tmb s’haguessin pogut crear aquests agregats i llavors, el que seria possible és que els macacs responguessin diferent que els humans a la presència d’aquests agregats. No obstant, això no ho hem pogut estudiar.

87 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

88 HIPÒTESI 6 6a hipòtesi: interacció de la part Fc del mAbLa Fc del mAb pot induir: Citotoxicitat depenent de complement (CDC) Citotoxicitat mediada per cèl·lules depenent d’anticòs (ADCC) Fagocitosi cel·lular depenent d’anticòs Les accions del TGN1412 en humans poden ser parcialment mediades per la interacció de la regió constant del mAb amb el FcRs d’altres cèl·lules, implicant un cross-linking del TGN mAb humanitzats del isotip IgG4, com el TGN1412, són ineficients a l’hora d’unir-se al FcRs del s primats no humans. degut a la cua de l’anticòs és diferent en humans i altres primats. Per això, podria ser una possible hipòtesis que explica la diferència dels efectes que es van donar en macacs i humans. De la fagocitosis cel·lular depndent d’anticòs no se’n diu res perquè no podia haver provocat els efectes observats en humans. Primer parlarem de l’activació del complement.

89 HIPÒTESI 6 6a hipòtesi: Activació del complementConjunt de proteïnes que actuen en cascada Dues vies d’activació: Alternativa Clàssica IgM IgA IgG1 IgG2 IgG3 IgG4? Activació del complement: El complement és un conjunt de proteïnes que actuen en cascada per eliminar patògens del cos o les seves toxines i indueixen inflamació. S’activa per dues vies (alternativa i clàssica) però només ens centrarem en la clàssica perquè és la que s’activa en resposta a complexes antigen-anticòs. Quan un anticòs de l’isotip IgM, IgA, IgG1, 2 i 3 s’uneix a l’antigen pateix un canvi conformacional a la regió Fc, que permet la unió del primer component de la via clàssica C1q i l’activació d’aquesta via (imatge). Tot i que el TGN és una IgG4, podria ser que en la humanització de l’anticòs s’haguessin fet canvis en la cua, que haguéssin augmentat la seva afinitat pel complement.

90 HIPÒTESI 6 6a hipòtesi Interacció amb FcREls diferents efectes poden ser deguts a una possible interacció del TGN1412 amb el rc Fcγ Els Rc Fc són Rc de la part constant de les immunoglobulines que estan presents en molts tipus cel·lulars com fagòcits, mastòcits, basòfils, monòcits ì cèl·lules endotelials (com podem veure a la imatge). Aquesta unió podia haver causat una alliberació massiva de citoquines, com va passar.

91 HIPÒTESI 6 6a hipòtesi Interacció amb FcRA la imatge veiem els tipus cel·lulars on estan presents els FcR.

92 HIPÒTESI 6 6a hipòtesi: Visilizumab Anticòs humanitzat contra CD3Isotip IgG2 Versió humanitzada de OKT3 Alliberació massiva de citoquines Crosslinking de les cèl·lules T (CD3) i cèl·lules efectores del SI (FcR) Humanització de l’anticòs Canvis aa 234 i 237 (Val  Ala) S’ha decidit estudiar aquesta hipòtesis perquè se sap que s’han donat casos semblants anteriorment, com en el cas del Visilizumab. El visilizumab és un anticòs dirigit contra la part invariant del Rc CD3. En el visilizumab es va humanitzar la part constant . Com a resultat no va presentar problemes en el complement, crosslinking amb altres cèl·lules ni interacció amb Rc FcR. La seva versió no humanitzada és l’anticòs monoclonal OKT3. En l’OKT3es van introduir mutacions en els aa 234 i 237 (Val to Ala) de la regió constant de la IgG2. Això va resultar en una disminució de la unió als FcR i menys activació del complement humà. Comparat amb l’OKT3 el visilizumab és menys mitogènic per les cèl·lules T i causa menys toxicitat deguda a l’alliberació de citoquines. Activació del complement disminuïda No interacció amb FcRγ No alliberació de citoquines

93 Interacció TGN1412 - RC FCγ Els macacs també tenen aquest receptor? SíHi ha diferències en la seqüència? Sí Els aminoàcids que difereixen estan implicats en la interacció?  construcció del model en humà i en macac. Per saber si la diferència dels efectes observats es devien a la interacció de la fracció constant del TGN1412 amb el receptor FCγ vam mirar si els macacs també tenien aquest receptor. En veure que si tenien aquest receptor el següent pas era mirar si els hi havia diferències en la seqüència dels receptors. Vam veure que hi havia 10 diferències. Per veure si aquests canvis podien afectar la interacció i estaven a la zona d’interficie vam construir un model de la interacció .

94 Interacció TGN1412 - RC FCγ ModelatgeEscollir un motlle que presenti el receptor i la fracció constant d’una IgG 1T89 : rc FCγ IIIB + fracció IgG1 2. Separar les cadenes del motlle $ /cursos/BE/programari/PERL/PDBtoSplitChain.pl -i 1T89.pdb -o 1T89_ 3. Unir les dues cadenes en un sol pdb (concatenar) 4. Transformar el pdb en una sola cadena $ perl /cursos/BE/programari/PERL/arrangeR.pl 1T83.pdb 1T89_BC.pdb Per fer el modelatge es va escollir un motlle de la base de dades pdb (1T89) que contenia la fracció constant d’una IgG i el Rc Fcgamma IIB. Per a la interacció es va decidir modelar la interacció del Rc amb només una de les dues cadenes pesants. Es va escollir la que tenia més homologia amb el TGN. Com que l’stamp no superposava correctament les estructures es va fer un stamp avançat. Per fer-lo era necessari unir les dues cadenes de Rc (c) i part constant de la cadena pesada (B) en un sol pdb.

95 Interacció TGN1412 - RC FCγ humà5. Fer l’alineament entre el TGN i el motlle, necessari per l’STAMP avançat ( totes.aln). 6. STAMP AVANÇAT $ aconvert -in c -out b totes.bloque $ alignfit -f totes.bloque -d totes.domain -out totes.trans $ stamp -l totes.trans -prefix totes > totes_stamp.pdb

96 Interacció TGN1412 - RC FCγ humà7. Imatge amb VMD  $ transform -f totes.1 -g -o totes_stamp.pdb TGN1412 1T83_BC Aquí es pot observar el resultat de l’stamp del Rc Fcgamma IIIB i el TGN, superposat amb la part constant de la cadena pesada que hi havia en el template 1T89.

97 Interacció TGN1412 - RC FCγ macacModelatge del Rc de macac Es van seguir els mateixos passos que en el model anterior Per estudiar la interacció entre el TGN i el receptor de macac es va haver de modelar a partir d’una seqüència obtinguda a ensembl. Després, per modelar la interacció es van seguir els mateixos passos que en el cas anterior amb l’humà. Rc macac TGN 1412

98 Interacció TGN RC FCγ 8. Optimització de la interacció 9. PISA Estudi de la interacció del TGN1412- RC FCγ humà La interacció s’ha optimitzat amb VMD (solvatació més minimització de l’energia) i s’ha fet un estudi de les interaccions entre les dues molècules amb el programa PISA. Veiem que la Gly 236 del TGN interacciona amb la Val 367 del Fcgamma. (ponts d’H).

99 Interacció TGN RC FCγ Estudi de la interacció TGN1412- RC FCγ humà La cadena vermella és el TGN1412 (B) i la cadena blava és el Fcgamma (A). Veiem que la Gly 236 del TGN interacciona amb la Val 367 del Fcgamma mitjançant un pont d’H.

100 Interacció TGN1412 - RC FCγ PISA:Interacció TGN- TGN1412- RC FCγ macac En macac observem dos ponts d’hidrogen: un entre la Gly 236 del Fc amb la Ile 154 del TGN, i la Phe 234 del FC amb la Gly 155 del TGN.

101 Interacció TGN RC FCγ Estudi de la interacció TGN1412- RC FCγ macac La cadena vermella és el TGN1412 (A) i la cadena blava és el Fcgamma (B). Per tant, veiem que en macac es creen dos ponts d’hidrogen, mentre que en humà només 1.

102 Interacció TGN RC FCγ La seqüència del FCγ en humà i macac difereixen en 10 aminoàcids Vam comprovar que només un dels AA es troba a la interfície: Ile 154 macac  Val 367 humà - Ile i Val són molt similars (hidrofòbics)  el canvi no deu interferir Vam mirar si els 10 AA diferents es trobaven en la zona d’interfície i si podien afectar en la interacció. Mitjançant VMD es van seleccionar els aa de la interacció. Si el Fcgamma només es trobés en humà, podríem pensar que els efectes observats són deguts a que el TGN interacciona per la part constant d’aquest receptor, ja que és un receptor d’Ig., però com que en macac també trobem aquest receptor no podem acceptar la hipòtesi. A més, alineant els dos receptors (de macac i d’humà) veiem que les seqüències són gairebé idèntiques (excepte en 10 AA). Per veure si aquestes diferències eren importants vam decidir modelar-ho per veure si aquestes diferències es trobaven en el lloc de la interacció. L’única diferència que vam veure en el lloc d’interacció és en la Ile154 (Fc) en el macac, per una Val en humà. No obstant, val i ile són tots dos hidrofòbics i per tant, el canvi creiem que no deu influir massa en la interacció. Per tant, rebutgem la hipòtesi ja que les dues espècies tenen el receptor i no hi ha diferències significatives i, per tant, l’efecte no es pot associar a això pq també s’hauria d’haver donat en macacs. Rebutgem la hipòtesi perquè les dues espècies tenen el receptor i no hi ha diferències significatives

103 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412-CD28 4a. Interacció TGN1412 amb paràleg 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

104 HIPÒTESI 7 7a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a 3AA transmembrana diferents que poden causar una resposta mantinguda de calci en les cèl·lules T. A la imatge tenim l’alineament entre el CD28 humà i el CD28 de macac, on veiem la regió transmembrana encerclada de color vermell. Els 3* indiquen els 3 AA diferents entre les dues espècies.

105 HIPÒTESI 7 7a hipòtesi Els diferents efectes poden ser deguts a 3AA transmembrana diferents que poden causar una resposta mantinguda de calci en les cèl·lules T. És possible que el CD28 humà tingui tres aminoàcids transmembrana diferents al CD28 de macac. Això pot ser que causi una resposta mantinguda de calci en les cèl·lules T. L’activació del CD28 pot causar una upregulation de molècules d’adhesió de la superfície de les cèl·lules T, com Cd11b, així com altres cèl·lules del sistema immunitari innat. Aquestes cèl·lules es poden unir a la mol·lècula 1 d’adhesió intracel·lular (ICAM1) de les cèl·lules endotelials. Els complexos T-cell endotelials tenen la capacitat de produir una producció ampliada de citoquines i dany local endotelial. A més, la citokine storm i la infiltració de neutròfils poden mediar el síndrome de la fuga capil·lar (capillary leak syndrome) amb una fallada multiorgànica. No sé si cal! c | The IS forms in a dynamic process on the T-cell plasma membrane, in which the five components of the TCR–CD28 microcluster aggregate to form a central supramolecular activation cluster (c-SMAC). The latter consists of a core of TCR and CD3 molecules, surrounded by a ring of CD28 molecules with associated protein kinase Cθ, which causes sustained T-cell activation.

106 HIPÒTESIS HIPÒTESIS RESULTAT 1a. Diferències zona interacció2a. Diferències concentració CD28 3a. Diferències afinitat TGN1412 4a. Interacció TGN1412 amb CTLA4 5a. Interacció TGN amb ell mateix 6a. Interacció per la part constant del TGN1412 7a. Resposta mantinguda de calci

107 QUÈ N’EXTRAIEM? No s’ha pogut confirmar cap hipòtesi de les que s’han estudiat. A més, a l’estudiar en profunditat el cas han sorgit noves preguntes que encara no s’han pogut resoldre per falta de temps i de recursos. Especialment tenint en compte que les nostres hipòtesis s’han dut a terme amb assajos in silico. Amb més temps hagués estat possible analitzar la ruta intracel·lular i les diferències transmembrana per veure si eren una possible causa dels efectes. En aquests casos, en què el temps i recursos són limitats, els mètodes computacionals són molt útils per fer una aproximació al problema i intentar plantejar i descartar les primeres hipòtesis.

108 ANNEX BASES DE DADES UTILITZADES PER BUSCAR SEQÜÈNCIES SwissProtBase de dades de seqüències de proteïnes Les proteïnes que es troben en aquesta base de dades presenten un alt nivell d’anotació. Per tant, se’n coneix la seva estructura 3D, la funció, les modificacions post-traduccionals… Presenten a més, alts nivells de descripció, nivells mínims de redundància i nivells alts d’integració amb altres bases de dades. Establerta en 1986 i mantinguda des del 2003 per el Consorci UniProt 1. Volem buscar la seqüència de CD28 de ratolí i per això utilitzem Swissprot, aquest intenta proveir una anotació d'alt nivell de descripció (com la descripció de la funció de una proteïna, els seus dominis estructurals, modificacions post-transduccional, variants, etc.), UniProtKB/Suwiss-Prot es una base de datos que engloba todo lo que se conoce sobre las proteínas. Fue establecida en 1986 y mantenida de 2003 por el consortium UNIPROT, una colaboración entre el instituto suizo de bioinformatica (SIB) y el depertamento de bioinformatica y biologia estructural de la universidad de Ginebra, el instituto europeo de bioinformatica (EBI) y el centro medico de investigación de informacion de proteina de la universidad de georgetown. 108

109 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER BUSCAR HOMOLOGIES PSI-BLASTVariant de BLAST utilitzada per buscar possibles homòlegs en organismes molt llunyans entre ells. Programa iteratiu que va calculant les seves pròpies matrius de substitució en cada iteració. El programa que utilitzem per cercar homologs es el PSI-BLAST (Position specific iterative BLAST) que funciona de manera iterativa en el qual cerca regions de seqüència o la seqüència sencera similars (homologues) a la proteïna diana que estem estudiant i amb els alineaments obtinguts (prevamient fets per BLAST) es fa una nova matriu de substitució per seguir cercant seqüències similars. PSI-BLAST utilitza matrius de score de posición específica derivades durant la cerca i és utilitzada per detectar relacions de distancies evolutives. Es pot fer mitjançcant via web o desde la terminal. 109

110 ANNEX BASES DE DADES UTILITZADES PER BUSCAR ESTRUCTURES PDBBase de dades que conté estructures 3D de proteïnes i àcids nucleics. Les estructures s’obtenen generalment per cristal·lografia de raigs X o RMN. Sota domini públic EL PDB es una base de dades on es troben les estructures 3D de las proteínas trobades experimentalment per las tecnicas de RMN o Raigs-X. per tent, busquem al PDB el model estructural de CD28 humano 110

111 ANNEX BASES DE DADES UTILITZADES PER BUSCAR ESTRUCTURES SCOPBase de dades manual que conté una classificació d’estructures basades en similaritats en la seqüència i estructura 3D Estructura jeràrquica basada en quatre nivells: classe, plegament, superfamília i família. EL PDB es una base de dades on es troben les estructures 3D de las proteínas trobades experimentalment per las tecnicas de RMN o Raigs-X. per tent, busquem al PDB el model estructural de CD28 humano 111

112 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER LA VISUALITZACIÓ D’ESTRUCTURES RasmolPrograma de gràfics moleculars que permet la visualització d’estructures de DNA, proteïnes i petites molècules. RasMol llegeix fitxers de coordenades moleculars en diversos formats i visualitza interactivament la molècula en la pantalla amb una gran combinació de colors i representacions (wireframe, cylinder stick bonds, CPK spheres, ribbons, structure, dot surface,...) The loaded molecule may be shown as wireframe, cylinder (Dreiding) stick bonds, alpha-carbon trace, spacefilling (CPK) spheres, macromolecular ribbons (either smooth shaded solid ribbons or parallel strands), hydrogen bonding and dot surface. Atoms may also be labelled with arbitrary text strings. Different parts of the molecule may be displayed and coloured independently of the rest of the molecule or shown in different representations simultaneously. The space filling spheres can even be shadowed. The displayed molecule may be rotated, translated, zoomed, z-clipped (slabbed) interactively using either the mouse, the scroll bars, the command line or an attached dials box. RasMol can read a prepared list of commands from a `script' file (or via interprocess communication) to allow a given image or viewpoint to be restored quickly. RasMol can also create a script file containing the commands required to regenerate the current image. 112

113 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER LA VISUALITZACIÓ D’ESTRUCTURES VMDModela, visualitza i analitza sistemes biològics Llegeix arxius PDB  mostra l’estructura Anàlisi de simulacions de MD Interpreta i acoloreix la molècula The loaded molecule may be shown as wireframe, cylinder (Dreiding) stick bonds, alpha-carbon trace, spacefilling (CPK) spheres, macromolecular ribbons (either smooth shaded solid ribbons or parallel strands), hydrogen bonding and dot surface. Atoms may also be labelled with arbitrary text strings. Different parts of the molecule may be displayed and coloured independently of the rest of the molecule or shown in different representations simultaneously. The space filling spheres can even be shadowed. The displayed molecule may be rotated, translated, zoomed, z-clipped (slabbed) interactively using either the mouse, the scroll bars, the command line or an attached dials box. RasMol can read a prepared list of commands from a `script' file (or via interprocess communication) to allow a given image or viewpoint to be restored quickly. RasMol can also create a script file containing the commands required to regenerate the current image. 113

114 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER LA REALITZACIÓ D’ALINEAMENTS ClustalWPrograma d’alineament múltiple de seqüències nucleotídiques o proteiques Alineament global, progressiu i automàtic Tria el millor match, i ens permet veure les identitats, similituds i diferències entre seqüències Facilita la identificació de regions de seqüència conservades 3. El següent pas es fer un alineament entre les dues seqüències, per aixo es fa servir ClustalW2.... is a general purpose multiple sequence alignment program for DNA or proteins. It produces biologically meaningful multiple sequence alignments of divergent sequences. It calculates the best match for the selected sequences, and lines them up so that the identities, similarities and differences can be seen. Evolutionary relationships can be seen via viewing Cladograms or Phylograms. The basic information they provide is identification of conserved sequence regions. This is very useful in designing experiments to test and modify the function of specific proteins, in predicting the function and structure of proteins, and in identifying new members of protein families. ClustalW is a fully automatic program for global multiple alignment of DNA and protein sequences. The alignment is progressive and considers the sequence redundancy. Trees can also be calculated from multiple alignments. Sequences can be aligned across their entire length (global alignment) 114

115 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER MODELAR ESTRUCTURES ModellerPrograma utilitzat per a modelar estructures 3D de proteïnes basant-se en la seva homologia o comparació S’ha d’aportar un alineament de seqüència per a ser modelat en base a estructures relacionades conegudes Modela comparant la informació estructural satisfent restriccions espacials Passem a modelar, per això utilitzem modeller que.... És un programa utilitzat per a modelar estructures 3D de proteines en base la seva homologia o comparació. L’usuari aporta un alineament de sequència per a ser modelat en base a estructures relacionades conegudes. El model obtingut no conté àtoms d’hidrogen. Modeller fa models comparant la informació estructural satisfent restriccions espacials i pot fer algunes tasques addicionals, com modelatge de novo de loops en estructures de proteïnes, optimització de diversos models d’estructures de proteïnes respecte una funció objectiva flexible, alineament múltiple de seqüències de proteïnes i/o estructures, clustering, cerca en bases de dades de seqüències, comparació d’estructures proteiques, etc.

116 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER SUPERPOSAR ESTRUCTURES STAMPPrograma utilitzat per a la comparació i alineament de seqüències proteiques 3D Dóna alineaments múltiples i la corresponent superimposició i també un mètode sistemàtic per a avaluar la qualitat dels alineaments Utilitza l’algorisme Smith-Waterman, que permet la ràpida determinació del millor camí a través d’una matriu que conté el càlcul de similituds entre parells de bases de les dues seqüències L’anàlisi avaluatiu el fa a partir del RMSD, puntuació de similitud estructural i puntuació residu a residu (Pij) STAMP és un programa utilitzat per a l’alineament de seqüències proteiques basat en estructures 3D. Dóna no només alineaments múltiples i la corresponent superimposición, sinó que també dóna un mètode sistemàtic i reproduïble per a avaluar la qualitat dels alineaments. També dóna un mètode per escannejar bases de dades estructurals. A part de la comparació estructural, el pack STAMP proporciona inputs per programes per a presentar i analitzar alineaments de seqüències i estructures terciàries. Encara que STAMP doni outputs d’alineaments de seqüència, és un programa per a estructures 3D, no per a seqüències. Utilitza l’algorisme Smith-Waterman, que permet la ràpida determinación del millor camí a través d’una matriu que conté la mesura numèrica de similaritats entre parells de bases per a cada posición en una seqüència a cada posición en l’altre seqüència. Fa un alineament jeràrquic: primer ho fa per parelles i després construeix un dendograma. L’anàlisi avaluatiu el fa a partir de RMSD, (“Root Mean Squire Deviation”, calculat entre carbonis alfa de residus aparellats a la millor superposición 3D de l’estructura de la query i del target. Es calcula en angstroms. Dóna una idea com de separats, a la millor superposición 3D, estan 2 àtoms c alfa aparellats) puntuación de similitud estructural (Sc) i la puntuación residu a residu (Pij).

117 ANNEX PROGRAMES UTILITZATS PER L’AVALUACIÓ DE MODELS PROSAProtein Structure Analysis Permet avaluar la qualitat energètica de l’estructura proteïca Veure les zones problemàtiques del model per a poder-les millorar Per avaluar el model energèticament fem servir PROSA....

118 ANNEX Procheck PROGRAMES UTILITZATS PER L’AVALUACIÓ DE MODELSPrograma per avaluar la qualitat estereoquímica d’una estructura proteica Paràmetres utilitzats en l’avaluació: - Paràmetres estereoquímics - Llargada dels enllaços - Angle dels enllaços Input: fitxer amb les coordenades de l’estructura proteica Output: plots i llista detallada residu per residu PROCHECK és un programa que serveix per avaluar la qualitat estereoquímica d’una estructura proteïca donada. L’objectiu és avaluar com de normal o a la inversa, com d’inusual, és la geometria dels residus de l’estructura avaluada. Això es fa comparant-se amb paràmetres estereoquímics derivats d’estructures d’alta resolució i refinades. Cal tenir en compte que les regions inusuals remarcades per PROCHECK no han de ser necessàriament errors ja que bé poden ser característiques inusuals per les quals hi ha una explicació raonable tot i que també poden haver-hi regions que calgui estudiar detingudament. Els paràmetres que utilitza PROCHECK per fer l’anàlisi deriven d’estudis realitzats i existeixen unes taules amb els valors mitjans per cada paràmetre. Es tenen en compte paràmetres esteroquímics com la quiralitat dels C alfa, els angles de torsió fi/psi de les hèlixs, etc, la llargada dels enllaços i els angles que es formen. El fitxer input conté les coordenades de l’estructura proteica en format Brookhaven i l’output que s’obté conté plots com el de Ramachandran o d’altres i una llista detallada residu per residu. 118

119 PREGUNTES PEM Respecte el TGN1412, senyala l’opció falsa:a) El TGN1412 és un anticòs monoclonal humanitzat contra el receptor CD28 b) El TGN1412 es considera un superanticòs c) El TGN1412 va provocar una alliberació massiva de citoquines en ratolins d) TeGenero és l’empresa que té la patent del TGN1412 e) El TGN1412 estava previst pel tractament de l’artritis reumatoide i la leucèmia limfocítica crònica. 2. Quina informació podem obtenir a partir d’un arxiu pdb: a) Coordenades cartesianes dels àtoms al sistema b) Nombre d’àtoms de la molècula c) Les dues anteriors d) B-factor e) Totes les anteriors 3. Pel que fa a les bases de dades públiques, quina opció és la falsa: a) El Swissprot només conté informació de les proteïnes cristal·litzades b) El PDB presenta una classificació d’estructures de proteïnes segons dos nivells de jerarquia: família i superfamília c) Al PDB podem trobar l’estructura de proteïnes cristal·litzades i no cristal·litzades d) A partir del PDB es pot extreure el fitxer pdb d’una proteïna però no el fitxer fasta. e) Totes les anteriors són falses

120 PREGUNTES PEM 4. Respecte el CD28 de macac i el CD28 humà assenyala la resposta correcta : a) Tan sols es diferencien en 3 aminoàcids de la regió transmembrana b) Hi ha moltes diferències a nivell del domini extracel·lular c) Hi ha moltes diferències a nivell del domini intracel·lular d) No hi ha cap diferència a nivell de seqüència e) Totes les anteriors 5. Quines de les següents tècniques hem pogut utilitzar per modelar l’estructura del TGN1412 en aquest treball : a) RMN b) Dicroïsme circular c) Les dues anteriors d) Mètodes computacionals 6. Quin programa es pot utilitzar per fer una avaluació energètica: a) Stamp b) Clustalw c) Modeller d) Prosa e) Cap de les anteriors

121 PREGUNTES PEM 7. Respecte el CTLA4, assenyala la resposta falsa:a) Té un domini immunoglobulin-like b) És un homòleg de CD28 c) La seqüència d’unió al super-agonista és completament igual a la seqüència del CD28 d) Transmet un efecte inhibitori a les cèl·lules T e) Totes les anteriors 8. Respecte el Visilizumab, assenyala la resposta falsa: a) És un anitcòs monoclonal humanitzat contra el receptor CD3 b) Es van modificar aminoàcids de la cua per tal d’evitar crosslinking c) Les dues anteriors d) Va produir els mateixos efectes en humans que el TGN1412, de manera que es va haver de retirar del mercat. Digues quina de les següents opcions és la vertadera: a) El PyDock és un programa d’elecció quan es vol predir l’estructura d’un complex de proteïnes a partir de les proteïnes per separat. b) Els programes d’interacció de proteïnes Z-dock i Ftdock es basen en la Transformada de Fourier. d) El resultat del PyDock dóna un llistat ordenat de les posicions relatives de les cadenes en funció de l’score de cada conformació possible.

122 PREGUNTES PEM 10. Respecte un anticòs monoclonal, assenyala la resposta correcta: 1. Està format per una cadena pesada i una cadena lleugera 2. La part variable de l’anticòs només es troba a la cadena lleugera. 3. La regió Fab conté la part d’unió a l’antigen 4. El fragment Fc de l’anticòs únicament conté un domini 1,2,3 1,3 2,4 4 1,2,3,4

123 BIBLIOGRAFIA Barclay AN. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - a master superfamily of interaction molecules. Seminars in Immunology. 2003; 15: 215–223. Hansel TT, Kropshofer H, Singer T, Mitchell JA, George AJT. The safety and side effects of monoclonal antibodies. Nature Reviews Drug Discovery. 2010; 9: Sondermann P, Kaiser J, Jacob U. Molecular Basis for Immune Complex Recognition: A Comparison of Fc- Receptor Structures. J. Mol. Biol. 2001; 309: Can super-antibody drugs be tamed? Nature. 2006; 440 (7086): Stobbart L, Murtagh MJ, Rapley T, Ford GA, Louw SJ, Rodgers H. We saw human guinea pigs explode. BMJ. 2007; 334 (7593): Farzaneh L, Kasahar N, Farzaneh F. The strange case of TGN1412. Cancer Immunol Immunother. 2007; 56:129 – 134 Rudd CE, Taylor A, Schneider H. CD28 and CTLA-4 coreceptor expression and signal transduction. Immunol Rev. 2009; 229(1): Evans EJ, et al. Crystal structure of a soluble CD28-Fab complex. Nat Immunol. 2005; 6(3):

124 BIBLIOGRAFIA Lühder F, Huang Y. Topological Requirements and Signaling Properties of T Cell–activating, Anti-CD28 Antibody Superagonists. J Exp Med. 2003; 197(8): 955–966. Horvath CJ, Milton MN. The TeGenero Incident and the Duff Report Conclusions: A Series of Unfortunate Events or an Avoidable Event? Toxicologic Pathology. 2009; 37: Schraven B, Kalinke U. CD28 Superagonists: What Makes the Difference in Humans? Immunity. 2008; 28 (5): Riley JL, June CH. The CD28 family: a T-cell rheostat for therapeutic control of T-cell activation. Blood ; 105(1):   Hünig T, Dennehy K. CD28 superagonists: mode of action and therapeutic potential. Immunol Lett. 2005; 100(1): 21-8. Yu QT, Saruta M, Papadakis KA. Visilizumab induces apoptosis of mucosal T lymphocytes in ulcerative colitis through activation of caspase 3 and 8 dependent pathways. Clin Immunol. 2008; 127(3): 322-9 Malviya G, D'Alessandria C, et al. Radiolabeled humanized anti-CD3 monoclonal antibody visilizumab for imaging human T-lymphocytes. J Nucl Med. 2009; 50(10):

125 ABP 32-36 Aprenent amb el TGN1412 Grup E.Arumí H, Ballestero M, Borralleras C, Codina M, Domènech A, Español N, Guixe M, Joyera M, Moscoso M, Suárez M