1 Aislamiento e identificación molecular de levaduras autóctonas de Colombia para la producción de etanol Pedro F. B. Brandão1, Adelina del Pilar Melendez2 y Mario E. Velásquez-Lozano3 1 Grupo de Estudios para la Remediación y Mitigación de Impactos Negativos al Ambiente (G.E.R.M.I.N.A.), Laboratorio de Microbiología Ambiental y Aplicada, Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA. 2 Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá - COLOMBIA 3 Grupo de Investigación de Procesos Químicos y Bioquímicos, Laboratorio de Ingeniería Bioquímica, Departamento de Ingeniería Química y Ambiental, Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá – COLOMBIA

2 Trabajo perteneciente al Proyecto: “Aislamiento, caracterización y evaluación de levaduras nativas del municipio de Puerto López (Meta) para la producción de etanol” Ejecutado por: Universidad Nacional de Colombia Financiado y Evaluado por: Colciencias y Ecopetrol Apoyo y interés comercial de: Ecopetrol y Bioenergy

3 Bioetanol en Colombia Alcohol carburante de Colombiacaña de azúcar valle geográfico del Río Cauca región con 13 ingenios azucareros y 5 destilerías de alcohol Otros puntos de interés objeto de estudio Costa Atlántica Hoya del río Suarez (Boyacá-Santander) Llanos Orientales (hasta el Tolima) Proceso general de obtención de alcohol carburante fermentación con levaduras empleando como sustrato los azúcares extraídos de la caña de azúcar Biocombustibles en Colombia, Consultada en:

4 Fermentación con levadurasMetabolismo etanol Conversión de hexosas

5 Proceso industrial de producción de bioetanolLevadura comercial Proceso controlado Reutilización levaduras

6 Levaduras Autóctonas vs. ComercialesPotencial para mejorar rendimientos de fermentación Mejor adaptación a los jugos de caña Mayor competencia contra otras levaduras autóctonas  Importante recuperar levaduras de las zonas de cultivo y proceso de la caña para obtener las que puedan contribuir a un mejoramiento del proceso local de fermentación Kosaric, N. and F. Vardar-Sukan, Potential source of energy and chemical products, in The Biotechnology of Ethanol: Classical and Future Applications. 2001, M. Roehr ed. Wiley-VCH:: New York.

7 Potencial levaduras autóctonas en la producción de bioetanolAparente baja diferencia en el rendimiento de etanol entre levaduras corresponde a un aumento de 2,1 millones de litros de etanol por temporada de cosecha en una destilaría de mediana capacidad. Basso L. C. et al (2008) Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil. FEMS Yeast Res 8 (2008) 1155–1163

8 Recuperación de Levaduras AmbientalesMuestras ambientales usadas para encontrar levaduras de interés Extenso proceso de aislamiento Posible presencia de réplicas de una misma cepa  Técnicas de diferenciación permiten discriminar réplicas y así utilizar cepas únicas en la fermentación

9 Métodos moleculares para diferenciar levadurasAnálisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción de regiones ITS (ITS-RFLP) Regiones ITS (Internal Transcribed Spacer) RNA no-funcional situado entre rRNA’s estructurales usado en taxonomía y filogenia microbiana alta variabilidad entre especies relacionadas fácil de amplificar por PCR (alto numero de copias de genes rRNA) Enzimas restricción

10 Métodos moleculares para diferenciar levadurasAnálisis de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción de ADN mitocondrial (mtDNA-RFLP) Alto poder de diferenciación de levaduras Método rápido y relativamente sencillo Digestión con HinfI o RsaI permite obtener polimorfismo con alto poder discriminativo

11 Métodos moleculares para diferenciar levadurasSeparación del cromosoma de levadura por electroforesis de campo pulsado (Cariotipado) Útil para identificación de cepas de levaduras Revela gran variabilidad de la composición del cromosoma Complejo, laborioso, consume tiempo cuando se requiere analizar muchas cepas

12 Objetivo general investigación desarrolladaRecuperación y aislamiento de levaduras autóctonas de Puerto López (Meta), Colombia, con potencial para la producción de etanol, y el establecimiento de metodologías moleculares para su identificación.

13 Procedimiento experimentalMuestreo Puerto López (Meta) Análisis molecular Aislamiento levaduras autóctonas Discriminación por huella molecular Secuenciación para identificación Selección morfológica levaduras Selección de cepas para análisis de fermentación Análisis de diversidad Formación cepario Aplicación industrial

14 Zonas de muestreo - Puerto López (Meta)Cultivo Caña Agua de irrigación Trapiche Productos fermentados (guarapo)  Se realizaron muestreos en época seca y de lluvias con el objetivo de recolectar diferente carga microbiológica

15 Muestras Ambientales Agua riego Suelo cultivo Caña de azúcarJugos de caña Mieles Melaza Bagazo Suelo con jugo de caña del trapiche panelero con olor a fermentado

16 Aislamientos Técnicas dependientes de cultivo Worten AgarPotato Dextrose Agar Yeast Glucose Chloramphenicol Agar

17 Cepario Se recuperaron 239 cepas de levaduras autóctonas de ColombiaPrimer cepario (epoca seca) Segundo cepario (epoca de lluvias) 105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ /112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2 No encontrado 107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ /110-1/110-6/112-4/120-6/120-8 Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843) Cepas patrón: A, B, Sucromiles 202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4 103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-3/108-2/ 108-3/112-2/113-3 106-1/107-2 105-2/105-4/105-7/115-1 112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 109-10 109-7 109-6 109-4 120-12/120-14 120-5/120-9/120-10/120-13 120-11 120-1 108-5 114-1 116-2/116-3/116-5 202-1/202-2 203-1/203-2 203-4 204-3/206-1/206-4/209-3 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5 205-8 208-6 210-3/215-1 212-2/212-5 212-4 212-6/212-7 213-9 213-10 215-3 Cepario Se recuperaron 239 cepas de levaduras autóctonas de Colombia  Junto con diferentes cepas patrón de Saccharomyces cerevisiae se llevó a cabo el análisis molecular

18 Identificación Molecular LevadurasMétodo enzimático (Liticasa) Amplificación de la región ITS (PCR) Extracción de ADN levaduras Purificación de los productos de amplificación Método mecánico (bead-beater) Secuenciación de las regiones ITS Análisis bioinformático de las secuencias (Blastn)

19 Análisis región ITS Levaduras AutóctonasDiferentes tamaños de fragmentos ITS entre levaduras Varias cepas mostraron ITS con el mismo tamaño  baja discriminación

20 Diferenciación Molecular de regiones ITSDiferenciación por huella molecular: Análisis ITS-SSCP  Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) variaciones en secuencia de ADN desnaturalizado se detecta por alteraciones en conformación secundaria de ADN de cadena sencilla (ssADN) en gel de poliacrilamida Conformación secundaria de ADN es dependiente de la secuencia de bases del fragmento Separación en el gel es dependiente de la conformación secundaria enrollada del ADN

21 Single-Strand Conformation PolymorphismMuestra A Muestra B Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante

22 Single-Strand Conformation PolymorphismMuestra A Muestra B Desnaturalización del DNA (95°C, 5 min.) Gel de poliacrilamida no-desnaturalizante

23 Single-Strand Conformation PolymorphismMuestra A Muestra B Carga de muestras en gel

24 Doblamiento de cadenas sencillas de ADNSingle-Strand Conformation Polymorphism Muestra A Muestra B Doblamiento de cadenas sencillas de ADN

25 Single-Strand Conformation PolymorphismMuestra A Muestra B Separación en el gel de las distintas conformaciones de cadenas sencillas de ADN

26 Posición final de las cadenas sencillas de ADN en el gelSingle-Strand Conformation Polymorphism Muestra A Muestra B Posición final de las cadenas sencillas de ADN en el gel

27 Single-Strand Conformation PolymorphismMuestra A Muestra B Perfiles de SSCP

28 Análisis ITS-SSCP  Se encontraron 39 perfiles ITS-SSCP únicos entre las 239 cepas aisladas Entre paréntesis se encuentran los códigos de las cepas nativas. La Cepa A y Sc son controles positivos de Saccharomyces cerevisiae, las letras A hasta Q designan los perfiles obtenidos para las muestras del primer cepario (recolectado en epoca seca) y las muestras 1-40 corresponden a las primeras amplificaciones del segundo cepario (recolectado en epoca de lluvias). Condiciones del gel de SSCP: 0.50X MDE, 17h corrida a 5W.

29 Perfil ITS-SSCP Primer cepario (Verano) Segundo cepario (Invierno) A 105-5/105-10/106-4/106-5/108-4/109-1 /110-2/110-3/110-5/112-6/112-8/112-9/ /112-11/112-12/113-1/113-2/ 113-5/117-1/117-2/117-3/117-4/ 117-7/117-8/120-4/121-1/121-2 No encontrado B S. cerevisiae 107-3/107-4/109-5/109-8/109-9/109-11/ /110-1/110-6/112-4/120-6/120-8 Cepa tipo: Saccharomyces cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843) Cepas patrón: A, B, Sucromiles 202-3/204-1/204-2/205-3/205-4/206-3/206-7/ 209-2/209-5/210-1/210-2/212-1/212-8/213-1/ 213-2/213-4/213-6/213-7/213-8/214-1/214-2/ 214-3/214-4/215-2/215-4/215-5/216-1/216-4 C 103-1/103-2/104-1/104-2/104-3/105-1 /105-8/105-41/105-16/106-3/108-2/ 108-3/112-2/113-3 D 106-1/107-2 E 105-2/105-4/105-7/115-1 F 112-1/112-3/112-5/112-7/117-5/117-6 G 109-10 H 109-7 I 109-6 J 109-4 K 120-12/120-14 L 120-5/120-9/120-10/120-13 M 120-11 N 120-1 O 108-5 P 114-1 Q 116-2/116-3/116-5 R 202-1/202-2 S 203-1/203-2 T 203-4 U 204-3/206-1/206-4/209-3 V 205-1/206-2/209-4/210-4/213-3 W 205-2/205-6/208-7/209-1/214-5 X 205-8 Y 208-6 Z 210-3/215-1 2A 212-2/212-5 2B 212-4 2C 212-6/212-7 2D 213-9 2E 213-10 2F 215-3 Compilación de perfiles ITS-SSCP únicos obtenidos para las cepas autóctonas de levaduras presentes en el cepario establecido  S. cerevisiae fue la única levadura recuperada en ambas épocas seca y lluviosa  Fragmentos de ADN correspondientes a perfiles ITS-SSCP únicos fueran secuenciados para su identificación

30 Identificación Levaduras AutóctonasPerfil ITS-SSCP Especie identificada % Identidad GenBank A Hanseniaspora guillermondii 99 B Saccharomyces cerevisiae C, S, 2F Meyerozyma caribbica 100 D, 2J Issatchenkia orientalis E Rhodotorula mucilaginosa F, U, 2C Wickerhamomyces anomalus H, J, W Pichia sp. CBS 241 (Zygopichia chevalieri var. Fermentati) I Candida parapsilopsis M Dekkera bruxellensis 95 N Torulaspora sp. XZ-46A (Torulaspora quercuum) O Candida intermedia Q Candida tropicalis R Toluraspora delbruekii V, 2B Pichia sp. YS110 (Pichia garciniae) Z, 2E, 2H Candida berthetii 2D Candida laemsonensis 98 2A Candida stellimalicola 2G Candida cf. sorbosivorans X Hanseniaspora opuntiae T Secuencia no reportada en bases de datos 86 G, K, L, P, Y, 2I, 2K, 2L, 2M Pendiente resultado - Identificación Levaduras Autóctonas * * * * Varias cepas han sido reportadas como contaminantes en plantas de producción de etanol ( ) S. cerevisiae  51 cepas entre las 239 levaduras analizadas  mostraron distintos perfiles metabólicos de fermentación indicando posible variabilidad intra-específica * * * * * * *  Basílio A. C. M. (2008) Detection and Identification of Wild Yeast Contaminants of the Industrial Fuel Ethanol Fermentation Process. Curr Microbiol (2008) 56:322–326 .

31 Diferenciación de subespecies de S. cerevisiaeAnálisis de regiones inter-delta  permite discriminación por debajo del nivel de especie Ness F. et al (1993) Identification of yeast strains using the polymerase chain reaction. J. Sci. Food Agric. 62,

32 S. cerevisiae evaluadas por análisis inter-deltaCódigo de la cepa de levadura Saccharomyces cerevisiae Primer cepario Segundo cepario 107-3 202-3* 209-2** 214-3 107-4 203-7 209-5 214-4 109-5 203-8 210-1 215-2 109-8 204-1* 210-2 215-4 109-9 204-2 212-1 215-5** 109-11 205-3 212-8 216-1 109-12 205-4 213-1 216-4 110-1 206-3 213-2 216-5 110-6 206-6 213-4 - 112-4* 206-7 213-6 Cepas patrón 119-1 206-9* 213-7 AH22 119-3* 207-2 213-8 A 120-6 207-3 214-1 B 120-8* 208-1 214-2 Sucromiles Las cepas indicadas con el símbolo * corresponden a las que pueden ser de mayor interés a futuro debido a su perfil de fermentación de acuerdo a los resultados de la actividades 3 y 7 del proyecto de investigación. Las cepas con el símbolo ** corresponden a cepas que son S. cerevisiae pero que por problemas de crecimiento en el momento de inocular en el medio YPG no se incluyen en los resultados obtenidos.

33 Análisis inter-delta de S. cerevisiae 20 perfiles inter-delta únicos  grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación

34 Compilación de perfiles inter-delta únicos obtenidos para las cepas de S. cerevisiae autóctonasCepa de levadura S. cerevisiae Perfil interdelta 212-1, 213-1 a A, SC ñ 216-1, 216-4, 107-4 b 209-2, 212-1 o 213-4, 214-3 b(I) 205-3 o(I) 215-4, 109-5 b(II) 206-3, 210-1, 210-2 p 213-7, 214-4 b(III) 207-2 p(I) 110-6, 110-1 c 206-6 p(II) 208-1, 109-8 c(I) 205-4 q 109-11 c(II) 215-2 q(I) 213-8 d B r 214-2 e AH22 s 107-3 f 120-6 t 109-9 g 206-9 u 112-4 i 202-3 v 119-1 j 207-3 w 119-3 k 209-5 x 204-1 l 213-6 y 204-2 m 214-1 z 206-7 n 213-2, 120-8, 203-7, 203-8, 216-5 No Amplificó 20 perfiles inter-delta únicos entre 51 cepas de S. cerevisiae  grupo de cepas únicas seleccionado para posteriores ensayos de fermentación

35 Fermentación con levaduras autóctonasVarias levaduras autóctonas mostraron nivel de producción de etanol similar a cepa control Densidad celular: 1x107 células viables/ml Temperatura fermentación: 30°C Sacarosa: 10% p/v Incubación: 24h

36 Conclusiones Aislamiento levaduras autóctonasMuestreo Puerto López (Meta) Conclusiones Cepario (239 cepas) 1 de los 39 perfiles corresponde al perfil de una cepa referencia S. cerevisiae Diferenciación por debajo del nivel de especie Amplificación de región ITS Amplificación y análisis de regiones inter-delta 50 levaduras autóctonas con perfil ITS-SSCP igual a cepa referencia S. cerevisiae Análisis SSCP Varias de las 50 cepas nativas S. cerevisiae mostraron perfiles metabólicos distintos 20 perfiles inter-delta únicos S. cerevisiae 39 perfiles ITS-SSCP únicos Fermentaciones con S. cerevisiae únicas Secuenciación de las 39 regiones ITS únicas Identificación a nivel de especie

37 Investigaciones en desarrolloSegunda fase del proyecto: “Producción de etanol de segunda generación a partir de hidrolizado de bagazo de caña por levaduras y bacterias autóctonas” Mejoramiento molecular de levadura autóctona Transformación de pentosas Resistencia a inhibidores Aislamiento de bacterias fermentadoras de pentosas Probar posible implementación de microorganismos aislados a nivel industrial (Bioenergy)

38 Agradecimientos Integrantes grupo ECOLEVUNAstrid Acevedo, Ángela Otálora, Alis Pataquiva, Luisa Gómez, Sandra Rodríguez, Juan Pablo Ortiz, Helver Lesmes Estudiantes integrantes grupo GERMINA Diana Vela, Iván López (2010-2) Jaime Sánchez (2011-1) L. Tatiana Morales, Aida Ramírez (2011-2) Yina Cifuentes (2012-1) Vivian Covo (2012-2) Entidades financiadoras

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40 Polymerase Chain Reaction (PCR)Reacción en Cadena de la Polimerasa

41 Polymerase Chain Reaction (PCR)Reacción en Cadena de la Polimerasa 

42 Se identificaron 39 perfiles únicos de ITS-SSCP entre el total de cepas de levaduras nativas presentes en el cepario El perfil ITS-SSCP correspondiente a la levadura patrón S. cerevisiae AH22 (NRRL Y-12843) resultó idéntico a 50 perfiles de levaduras nativas indicando que las mismas pueden ser relacionadas con esta especie Las 50 cepas nativas con perfil ITS-SSCP idéntico a S. cerevisiae mostraron perfiles metabólicos distintos  sugiere diferencias por debajo del nivel taxonómico de especie (subespecie) CONCLUSIONES

43 El análisis de regiones interdelta permitió la diferenciación de las 48 cepas nativas que se encuentran asociadas a la especie Saccharomyces cerevisiae: 32 cepas nativas de S. cerevisiae resultaron con perfiles únicos interdelta 11 cepas nativas de S. cerevisiae resultaron con perfil interdelta idénticos y pueden ser consideradas replicas en el cepario 4 cepas patrón de S. cerevisiae resultaron en 3 perfiles diferentes  cepas A y Sucromiles tienen mismo perfil interdelta No se pudieron amplificar regiones interdelta de 5 cepas (en estudio) CONCLUSIONES

44 De los 39 perfiles ITS-SSCP únicos encontrados para las levaduras nativas presentes en el cepario, se han identificado hasta el momento 6 especies. 7 secuencias de genes ITS que resultaron en perfiles ITS-SSCP únicos están bajo estudio para lograr una identificación al nivel de especie. Los restantes genes ITS de las cepas nativas que mostraron perfil ITS- SSCP únicos están en proceso de secuenciación. Una vez todas las secuencias de los genes ITS resulten establecidas para cada cepa nativa de levadura se realizará un análisis filogenético para estudiar su diversidad. CONCLUSIONES