1 Aktualne metody typowania tkankowego, zgodność pary dawca biorcaJacek Nowak Zakład Immunogenetyki, Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Konferencja POLTRANSPLANT: „Szkolenie osób, których czynności bezpośrednio wpływają na jakość komórek krwiotwórczych, a także na bezpieczeństwo dawców i biorców”. Warszawa, Hotel Sobieski, 8-9 grudnia 2011 r.

2 Metody genotypowania HLATesty HLA Rozdzielczość Niska Pośrednia Wysoka PCR-SSP PCR-SSOP PCR-SSOP Luminex PCR-SSOP Luminex HD PCR-RSCA PCR-SBT (met. Sangera) PCR-SBT (pyrosekwencjonowanie)

3 Porównanie metod SSP i SSOPIzolacja DNA Amplifikacja DNA swoista wiele par primerów krótkie fragmenty (primery flankują krótkie miejsca polimorficzne exonu) Elektroforeza wielu produktów PCR Odczyt Analiza komputerowa konstelacji dodatnich PCR Interpretacja immunogenetyczna SSOP Izolacja DNA Amplifikacja DNA nieswoista jedna para primerów długi fragment (primery flankują cały exon) Hybrydyzacja swoista (wiele swoistych sond na pasku nitrocelulozy) Barwienie produktów hybrydyzacji, odczyt Analiza komputerowa konstelacji dodatnich sond Interpretacja immunogenetyczna

4 PCR SSP 1. Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej PCR - DNA- Taq polimeraza - dNTPy - Bufor, Mg2+ 2. Przeniesienie do wielu probówek reakcyjnych o różnej swoistości - swoiste primery

5 PCR SSP 3. Reakcja PCR - wiele amplifikacji swoistych- denaturacja - renaturacja (hybrydyzacja) - elongacja 3. Przeniesienie na żel agarozowy (ważne pozycjonowanie dołków).

6 PCR SSP 5. elektroforeza 6. transiluminator

7 PCR SSP 7. Zdjęcie i analiza wzoru prążków (archiwizacja)

8 PCR SSP 7. Analiza wzoru prążków

9 PCR SSO

10 PCR SSO - wzór prążków

11 RSCA, (Reference strand conformation analysis) Analiza konformacji referencyjnej nici DNA

12 SBT (met. Sangera) Izolacja DNA Amplifikacja 1 (swoista dla exonu)Klasa I – exony 2 i 3 Klasa II – exon 2 Dodatkowe exony (4,5,6,7) Oczyszczanie Amplifikacja 2 (nested PCR) wraz terminacją znakowanymi nukleotydami kończącymi Elektroforeza kapilarna Detekcja laserowa i określenie sekwencji nukleotydów Analiza porównawcza bibliotek sekwencji alleli HLA

13 SBT, (Sequence-based typing) Sekwencjonowanie

14 SBT, (Sequence-based typing) Sekwencjonowanie

15 Pyrosekwencjonowanie polega na syntezie kolejnych nukleotydów i detekcji wydzielanego PPi

16 Stopniowe rozszerzanie typowania HLA1. Wstępne typowanie chorego A, B, DRB1 l.r. (dobór rodzinny, skierowanie na poszukiwanie dawcy niespokrewnionego 2. Wstępne typowanie dawców do rejestru (j.w.) 3. Typowanie potwierdzające w doborze rodzinnym - A, C, DRB1(ew. DQB1) l.r. 4. Typowanie uzupełniające dawców - Wybrane locus l.r./H.R., kilku dawców jednocześnie 5. Typowanie potwierdzające w doborze dawcy niespokrewnionego - C i DQB1 l.r. oraz A, B, C, DRB1 i DQB1 H.R.

17 Czynniki wpływające na wynik przeszczepu} HLA rozpoznanie faza choroby dawka komórek CD34+ status CMV i inne herpeswirusy płeć wiek chorego/dawcy grupa krwi AB0 wiek dawcy mHA polimorfizm KIR i cytokin Kumulatywny wpływ na wynik przeszczepienia

18 Prawdopodobieństwo przeżycia chorych w zależności od liczby niezgodnych alleli lub antygenów HLA-A, B, C, DRB1 i DQB1 wyznaczane metodą Kaplana-Meiera. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation.

19 [C*-B*-DRB1*] jest centralną częścią haplotypu HLATabela 4.4. Śmiertelność całkowita pacjentów po transplantacji krwiotwórczych komórek macierzystych. Proporcja ryzyka (hazard ratio) w regresyjnym modelu wielu zmiennych w zależności od niezgodnego locus. Analizę ograniczono do par z pojedynczą niezgodnością. Według 13-th International Histocompatibility Working Group in Hematopoietic Cell Transplantation. [C*-B*-DRB1*] jest centralną częścią haplotypu HLA

20 Niezgodność allelu lub antygenu klasy I vsNiezgodność allelu lub antygenu klasy I vs. zgodność (Przewlekła choroba GvH) ...ale w analizie wieloczynnikowej (multivariate analysis), niezgodność allelu HLA klasy I nie miała istotnego wpływu na OS (P=0.18). Greinix HT et al. (2005) Bone Marrow Transplantation 35, 57–62

21 Źródła przeszczepu komórek krwiotwórczychDawca klasyczny rodzeństwo Dawcy alternatywni dawcy niespokrewnieni zgodni ( ) krew pępowinowa prawie zawsze niezgodna ( ) niespokrewnieni częściowo niezgodni pozostali członkowie rodziny i haploidentyczni Preferujemy poszukiwanie najlepszego możliwego dawcy we wszystkich dostępnych źródłach.

22 Kryteria doboru dawcy rodzinnego spośród rodzeństwaPełna zgodność w 4 (5) loci na poziomie niskiej rozdzielczości A, B, Cw, DRB1, (DQB1) Rzadko możliwa jest optymalizacja doboru dawcy rodzinnego (płeć, CMV, grupa krwi) - jeśli jest więcej niż 1 potencjalny dawca

23 Dawca rodzinny spośród rodzeństwaCel typowania HLA: 1. Wykazanie, że dawca odziedziczył te same haplotypy HLA co chory 2. Wykluczenie zjawiska crossing over

24 Dziedziczą się całe haplotypy HLA, tworząc genotypyA*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a ojciec b A*2402 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 A*0301 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 c matka d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a pacjent d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 rodzeństwo a/c a/d b/c b/d

25 Rekombinacja w obszarze MHC (1%) = nowy haplotyp/genotypA*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a ojciec b A*2402 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 A*0301 Cw*0702 B* DRB1*1501 DQB1*0602 c matka d A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1301 DQB1*0603 A*0101 Cw*0701 B* DRB1*0301 DQB1*0201 a pacjent d+c A*2501 Cw*1203 B* DRB1*1501 DQB1*0602

26 Obliczanie szansy znalezienia przynajmniej jednego zgodnego dawcy w zależności od liczby rodzeństwa 0.25 = prawdopodobieństwo przy 1 osobie, n = liczba osób P = 1 - (1 – 0.25)n

27 Wynik rodzinnego typowania HLA musi być zgodny z zasadami dziedziczenia.Allele wszystkich loci pochodzą od biologicznych rodziców, po jednym od każdego z nich; Tylko 4 haplotypy w rodzinie; Możliwa jest rekombinacja (crossing over), ale rzadko; Nie można dziedziczyć dwóch haplotypów od jednego rodzica, ale rodzic może być zgodny z dzieckiem (rzadko) Podwójna rekombinacja praktycznie nie występuje, itp…

28 Szansa na pełną zgodność HLA pomiędzy rodzicem a dzieckiem (npSzansa na pełną zgodność HLA pomiędzy rodzicem a dzieckiem (np. jeśli oboje rodzice dziedziczą taki sam haplotyp) 1-3% Optymalizacja - 1 haplotyp wspólny

29 Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie choregoZakres: A,B,DRB1; n.r.

30 Wstępne badanie HLA w najbliższej rodzinie choregoZakres: A,B,DRB1; n.r. Potwierdzające badanie HLA chorego i zgodnego członka rodziny (1 lub więcej) Zakres: A,B,C,DRB1,(DQB1); n.r. Nowe próbki

31 Brak dawcy rodzinnego

32 Dawcy niespokrewnieni a rodzinniCzęstości skumulowane (A) całkowitego przeżycia, (B) przeżycia wolnego od choroby, (C) śmiertelności związanej z przeszczepieniem, (D) GVHD stopnia II do IV, (E) wznowy, i (F) GVHD stopnia III do IV u 236 pacjentów, zależnie od typu dawcy Yakoub-Agha, I. et al. J Clin Oncol 2006; 24: Copyright © American Society of Clinical Oncology

33 Kryteria doboru dawcy niespokrewnionegoPełna zgodność w 5 loci A, B, Cw, DRB1, DQB1 na poziomie alleli Optymalizacja 1. Poprawa rozdzielczości typowania HLA 2. Poprawa przygotowania i leczenia powikłań potransplantacyjnych u pacjenta

34 1. dawca z Niemiec Etap CT: DKM zgłosił astmę oskrzelową.

35 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

36 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

37 2. dawca z Kanady: Etap CT: CAUB Niezgodność 1 allelu w locus B; Fenotypowo zgodny w 10/10 alleli

38 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. JBłędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

39 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. JBłędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

40 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. JBłędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

41 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. JBłędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

42 Błędne typowanie pacjenta Pacjent B. JBłędne typowanie pacjenta Pacjent B.J. Wykryto błędne typowanie w locus A. Dobrano zgodnego dawcę krajowego.

43 Błędne typowanie pacjenta prowadzi do:fałszywej oceny szansy na znalezienie dawcy, błędny kierunek poszukiwań, opóźnienie.

44 Błędne typowanie pacjenta Pacjent S. TBłędne typowanie pacjenta Pacjent S.T. Wykryto błąd typowania w dwóch loci (A, DRB1). Dobrano dwóch rodzinnych dawców.

45 Błędne typowanie pacjenta Pacjent S. TBłędne typowanie pacjenta Pacjent S.T. Wykryto błąd typowania w dwóch loci (A, DRB1). Dobrano dwóch rodzinnych dawców.

46 Pokrewieństwo małżeństw Dziedziczenie dwóch identycznych haplotypów przez obustronnego kuzyna i pacjentkę V.B. a,c a,f b,d b,h f,b a,b f,h Pacjentka V.B. Zgodny kuzyn P.B. b,g d,h a,e c,f Rodzice pacjentki Rodzeństwo rodziców pacjentki Badanie HLA u wszystkich obustronnych kuzynów chorej Haplotypy pacjentki: a - A*02-B*49-Cw*07-DRB1*0401-DQB1*0302 b - A*25-B*18-Cw*12-DRB1*1501-DQB1*0602

47 Dobór NDSz w zakresie ligandów KIR

48 Struktura cząsteczki HLA klasy Iα-helix, ARS - Antigen Recognition Site α1 Rowek, β-pofałdowana kartka Prezentowany peptyd α2 Struktura cząsteczki HLA wiążąca peptyd i TCR lub KIR jest to łańcuch polipeptydowy. Tworzy on rowek składający się z dna rowka (β-pofałdowana kartka) i jego brzegów (α-helix). Różnica (substytucja) aminokwasów tworzących rowek jest podstawą niezgodności HLA. β2-mikroglobulina α3 Histocheck, in: Elsner et al. Bone Marrow Transplantation (2004) 33, 165–169

49

50 Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLANiezgodność TCR-MHC Brak niezgodności KIR 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA.

51 Typ KIR jest wiązany przez supertypową grupę antygenów HLANiezgodność TCR-MHC oraz niezgodność KIR 1. Mary Carrington, et al. The KIR Gene Cluster. 2003:National Library of Medicine NCBI, Bethesda MD, USA.

52 Potencjalne znaczenie ligandów KIR w HSCTNiezgodność ligandów KIR w kierunku GvH Korzystny efekt GvL1) szczególnie w białaczce szpikowej3) z tylko nieznacznym efektem GvH1) immunoablacja2) 1) Ruggieri L, et al. 1999, Blood 94, 333-9 2) Ruggieri L, et al. 2000, Blood 96, 473a 3) Giebel S, et al. 2003, Blood 102, 814-9

53 Korzystny wpływ niezgodności ligandów KIR (OS i DFS) Kierunek GvH, pacjenci CML, leczenie ATGGiebel S, Locatelli FW, Lamparelli T, et al. Survival advantage with KIR ligand incompatibility in hematopoietic stem cell transplantation from unrelated donors. Blood. 2003;102:

54 Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - TAK Wniosek: Nie ma niezgodności KIR

55 Selekcja dawców w zakresie ligandów KIR1. Jakie są dozwolone KIR u dawcy? 2. Czy HLA biorcy je zahamują? Ad 1: KIR dawcy (kierunek GvH) - KIR2DL1; 2DL2/3 Ad 2: Czy biorca je zahamuje? - NIE Wniosek: Wystąpiła niezgodność KIR

56 KIR Ligand Calculator (Zgodni) http://www. ebi. ac. uk/ipd/kir/ligand•Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9

57 KIR Ligand Calculator (Niezgodność GvH = GvL) http://www. ebi. acChory:B.Ł. dgn. AML •Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Marsh SGE. IPD - the Immuno Polymorphism Database Nucleic Acids Research (2010), 38: D863-9

58 OS, DFS, wznowa związana z przeszczepieniemBornhauser, M. et al. Blood 2004;103: Copyright ©2004 American Society of Hematology.

59 Potencjalny wpływ niezgodności ligandów KIR w HSCTDobór dawcy KK niezgodnego w zakresie ligacji KIR MOŻE BYĆ KORZYSTNY KLINICZNIE. Współistnienie niezgodności dwóch typów (NK i T-komórkowej) na tej samej cząsteczce HLA: 1. Utrudnia wykazanie korzystnego wpływu niezgodności ligandów KIR 2. Utrudnia selekcję dawców z wybiórczą niezgodnością KIR

60 Tylko w przypadku wystąpienia więcej niż 1 potencjalnego dawcy komórek krwiotwórczych (ABDR) można rozważać dalszą selekcję optymalnego dawcy: Polimorfizm immunogenetyczny 1. KIR 2. HLA-DPB1 3. mHag 4. Polimorfizm limfokin, chemokin, receptorów (NOD2/CARD15, IL6, IL10, TNF, IFNG, CCR5, SDF-1/CXCL12 i inne) Cechy biologiczne: 1. Status CMV 2. Płeć 3.Wiek 4. Grupa krwi AB0 5. Pochodzenie etniczne

61 Dane pacjenta powinny być znane przed selekcją dawcyCechy biologiczne Dane pacjenta powinny być znane przed selekcją dawcy 1. Status CMV - Zgodność statusu 2. Płeć - Dawcy płci męskiej - lepsi 3. Immunizacja, - Liczba ciąż, Liczba przetoczeń 4. Wiek, - Młodsi dawcy - lepsi 5. Pochodzenie etniczne

62 Czy uwzględniać DPB1 ? 6p21.31 38.4%1)A Cw B TNF LTA DRB1 DQB1 DPB1 13.2%2) 38.4%1) Procedury zakończone doborem 10/10 alleli3) - IHiT ,3% - DCTK - 69,7% RR=1.77; P=0.0061 - Medigen - 60,4% RR=2.66; P=0, - CSK WUM 74,4% RR=1.40 ; NS 1. Tiercy et al. Bone Marrow Transplant 2000, 26(4), 2. Hurley et al. Bone Marrow Transplant 2000, 25(4), 3. Żalikowska-Hołoweńko. Poltransplant, Biuletyn Informacyjny

63 Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność na poziomie alleli? - raczej nieZgodność w zakresie grup T-cell epitop (TCE)? HLA-DP niezgodne 10/10, N=2705; Shaw, Tissue Antigens 2007

64 Grupy DPB1 w zakresie TCE (T-cell epitop) 3 i 4

65 Czy uwzględniać DPB1 ? Zgodność DPB1 pomiędzy dawcą a biorcą komórek krwiotwórczych MOŻE MIEĆ ZNACZENIE KLINICZNE. Uzasadnione są dalsze badania, zwłaszcza nad wyjaśnieniem mechanizmu immunologicznego.

66 Algorytm poszukiwania niespokrewnionego dawcy przedstawiony przez POLTRANSPLANT ma brakiNie uwzględniono etapu “further typing”, który zmniejsza koszty i przyśpiesza dobór Nie uwzględniono jednoczesnego badania większej liczby dawców bez sprowadzania ich próbek Nie uwzględniono zakresu informacji dodatkowych koniecznych do uzyskania na etapie typowania potwierdzającego dawcy (CMV, inne IDM, liczba przetoczeń i ciąż, grupa krwi, wywiad lekarski, przynależność etniczna, płeć, wiek itp.).

67 Wnioski Genotypowania HLA przy użyciu różnych metod o poziomie rozdzielczości odpowiednim do sytuacji znajduje zastosowanie w procedurach doboru dawców komórek krwiotwórczych. Zgodność HLA 10/10 pomiędzy dawcą a biorcą KK stanowi podstawowy warunek skutecznego leczenia transplantacyjnego. Dobór HLA-DPB1 może pozwolić na poprawę przeżywalności chorych, lecz również zwiększyć odsetek wznowy. Wymaga dalszych badań. Korzystna niezgodność ligacji KIR zawsze wiąże się z niezgodnością T-komórkową. Wymaga istotnych modyfikacji przygotowania immunosupresyjnego pacjenta.