1 Algoritmos iterativos de tomografía tridimensional en microscopía electrónica Carlos Óscar Sánchez Sorzano Unidad de BioComputación Centro Nacional de Biotecnología (CSIC) Directores: J.M.Carazo y Fco. Del Pozo

2 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

3 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

4 Estudios estructurales Estudios bioquímicos Introducción al problema biológico Proteínas Sustratos MEFVALGGPDAGSPTPF PDEAGAFLGLGGGERTE AGGLLASYPSGRVS... Propiedades: Solubilidad, peso, tamaño, temperatura de desnaturalización,...

5 Introducción al problema biológico Microscopio electrónico filamento ánodo columnalente condensadora lente objetivo portamuestras lente proyectadora pantalla fosforescente placa fotográfica

6 Introducción al problema biológico Rango de estructuras estudiadas por microscopía electrónica de transmisión 10 nm. 1  m. 100 nm. proteínaribosomavírusmitocondria

7 Introducción al problema biológico Tinción negativa Criomicroscopía

8 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

9 Introducción a la tomografía tridimensional Concepto

10 Las imágenes de Microscopía Electrónica son imágenes de proyección (Transformada de Rayos X) de la densidad electrónica del espécimen (aproximadamente)Las imágenes de Microscopía Electrónica son imágenes de proyección (Transformada de Rayos X) de la densidad electrónica del espécimen (aproximadamente) Suposición: Objeto de Fase Débil (Weak Phase Object) (La dispersión (scattering) inelástico es tolerable frente al elástico y éste se considera un proceso lineal) Transformada de rayos X donde

11 Introducción a la tomografía tridimensional Inversión de la Transformada de Rayos XInversión de la Transformada de Rayos X Donde es la proyección de sobre La distribución de densidad f(r) está determinada de forma única por el conjunto de todas sus integrales de línea. Además, las proyecciones recogidas no responden a las proyecciones exactas de f(r).

12 Introducción a la tomografía tridimensional Algoritmos de expansión en serie 10 Millones de ecuaciones 1 Millón de incógnitas

13 Introducción a la tomografía tridimensional Expansión en blobs sobre una rejilla centrada en el cuerpo (BCC)

14 Introducción a la tomografía tridimensional - Proyectar Retroproyectar x (k)... Iterar (n veces) G.T. Herman. Academic Press 1980 R.Marabini et al. Uñtramic. 72:53-65 1998 Técnica de reconstrucción algebraica por bloques (ARTk)

15 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

16 Optimización del proceso de reconstrucción Reducción del espacio a reconstruirReducción del espacio a reconstruir Optimización del blob y rejilla de reconstrucciónOptimización del blob y rejilla de reconstrucción Optimización de parámetros libres mediante simulaciónOptimización de parámetros libres mediante simulación Optimización del orden de las proyeccionesOptimización del orden de las proyecciones Estudio de normalizaciónEstudio de normalización

17 Optimización del proceso de reconstrucción Optimización del blob y rejilla de reconstrucción E. Garduño et al. Electronic Notes in Theor. Comp. Sci. 46 2001 S. Matej et al. IEEE Trans. Med. Im. 15: 68-78 1996 Error alpha radio

18 Optimización del proceso de reconstrucción Optimización del blob y rejilla de reconstrucción

19 Optimización del proceso de reconstrucción Optimización de parámetros libres Simulación del proceso de reconstrucción partiendo de volúmenes conocidosSimulación del proceso de reconstrucción partiendo de volúmenes conocidos –Phantoms analíticos –Especímenes de estructura atómica conocida C.O.S. Sorzano et al. J. Struct. Biol. 133(2): 108-118 2001

20 Optimización del proceso de reconstrucción Definición conceptual de (algunas) tareas y de sus Figuras de Mérito (FOM´s) asociadas:Definición conceptual de (algunas) tareas y de sus Figuras de Mérito (FOM´s) asociadas: –Consistencia estructural: FOM: Norma L 2 y L 1 del error FOM: Coincidencia de medias y varianzas FOM: Resolución, correlación, información mutua … –Separabilidad estructural: FOM: Solapamiento histogramas de fondo y señal FOM: Separabilidad estadística entre medias …

21 Optimización del proceso de reconstrucción FOMs: Fourier Shell Correlation (FSC) M. Van Heel, Ultramicroscopy 21:95-100 1987

22 Optimización del proceso de reconstrucción Análisis estadístico intra-experimento –Realizar una serie de reconstrucciones para j –Evaluar cada reconstrucción obteniendo FOM i ( j ) –Eliminación de elementos no representativos, FOMs cuya media no alcanza una precisión deseada a cada j, y FOMs no correlacionadas con –Agrupación de FOMs por tendencias –Elección de un representante de clase –Combinación de los representantes de clase –Selección de la región óptima para este experimento Análisis estadístico inter-experimentoAnálisis estadístico inter-experimento –Identificación de variables relevantes –Determinación de un modelo para frente a dichas variables Optimización de parámetros libres

23 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

24 Corrección de la función de transferencia del microscopio Modelo teóricoModelo teórico Estimación del modelo teórico de cada micrografíaEstimación del modelo teórico de cada micrografía –Estimación espectral –Ajuste del modelo teórico a dicha estimación Corrección de la función de transferencia a partir del modelo teórico encontradoCorrección de la función de transferencia a partir del modelo teórico encontrado

25 J. Frank CRC Press 1996 Corrección de la función de transferencia del microscopio Función de transferencia

26 Corrección de la función de transferencia del microscopio Estimación espectral Promediado de periodogramas Modelado autoregresivo y media móvil (+) Menor varianza que promediado de periodogramas (+) Menor región de soporte R. L. Kashyap IEEE Trans. Inf. Theory 30(5): 736-45 1984

27 Corrección de la función de transferencia del microscopio

28 Ajuste de parámetros

29 Corrección de la función de transferencia del microscopio Corrección de CTF x(-1)

30 Corrección de la función de transferencia del microscopio Refinamiento Iterativo de Datos G.T. Herman et al. Optical Eng. 29:513-23 1990

31 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

32 Conocimiento a priori Simetría puntualSimetría puntual Restricciones volumétricasRestricciones volumétricas –Superficie –Volumen –Positividad –Solución inicial

33 Conocimiento a priori Simetría Planos de simetría para un eje rotacional de orden 6 La simetría supone el conocimiento de otras proyecciones

34 Conocimiento a priori Restricciones volumétricas

35 Restricciones a nivel volumétrico Solución inicialSolución inicial SuperficieSuperficie PositividadPositividad VolumenVolumen

36 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

37 Optimización de parámetros Análisis intra-experimento

38 Optimización de parámetros Análisis inter-experimento

39 Optimización de parámetros N. Boisset et al., Ultramic. 74:201-7 1998 ART, SIRT: Parámetro óptimo SIRT: Parámetro no óptimo

40 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

41 Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

42 Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

43 Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

44 Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40 21Å 33Å 14Å 15Å Frecuencia (1/Å) FSC

45 Contenido IntroducciónIntroducción –Introducción al problema biológico –Introducción a la tomografía tridimensional Materiales y MétodosMateriales y Métodos –Optimización del proceso de reconstrucción –Corrección de la función de transferencia del microscopio –Conocimiento a priori –Reconstrucción de cristales ResultadosResultados –Optimización de parámetros –Reconstrucción de partículas individuales ConclusionesConclusiones

46 Conclusiones Se ha puesto a punto un paquete de programas en el que las ideas expuestas en la presente tesis están disponibles y ya han sido utilizadas en estudios concretos. Se ha desarrollado un método de estimación de la función de transfencia de contraste teórica (CTF). Se ha desarrollado un mecanismo de corrección de la función de transferencia de contraste, tanto en fase como en amplitud. Se ha desarrollado un método de optimización útil en entornos con una alta variabilidad, un amplio número de variables independientes y múltiples funciones objetivo a optimizar.

47 Conclusiones Se han propuesto modelos para una gran variedad de parámetros utilizados durante el proceso de reconstrucción.Se han propuesto modelos para una gran variedad de parámetros utilizados durante el proceso de reconstrucción. Se han incorporado mecanismos de introducción de información a priori en el propio proceso de reconstrucción.Se han incorporado mecanismos de introducción de información a priori en el propio proceso de reconstrucción. Se han extendido los métodos iterativos de reconstrucción tridimensional a estudios con cristales bidimensionales.Se han extendido los métodos iterativos de reconstrucción tridimensional a estudios con cristales bidimensionales. Todas estas aportaciones han contribuido a una mejora de la calidad de los volúmenes obtenidos materializada en una mejora apreciable de la resolución alcanzada en un valor entre 10Å y 15Å de resolución.Todas estas aportaciones han contribuido a una mejora de la calidad de los volúmenes obtenidos materializada en una mejora apreciable de la resolución alcanzada en un valor entre 10Å y 15Å de resolución.

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49 Introducción

50 DnaB: crio-microscopía 1 6 11 16 21

51 Complejo DnaB/DnaC 16 1116 2126 DnaCDnaB 91 Å

52 Evolución del número de estructuras depositadas en PDB PDB Annual Report 2001 http://www.rcsb.org/pdb/annual_report01.pdf

53 objeto tridimension al proyeccione s en todas las direcciones posibles algoritmos de reconstrucción reconstrucción tridimensional Bases de la Microscopía Electrónica Tridimensional 3. Es posible reconstruir la estructura tridimensional de un objeto a partir de sus proyecciones

54 Material biológico: flexible alto contenido en agua sensible a radiación genera poco contraste Tinción negativa: deshidratación ¿tinción parcial? deformación / compresión la imagen refleja la forma del “molde” Criomicroscopía: entorno hidratado/fisiológico menor riesgo de deformaciones la imagen refleja la masa del especimen

55 Partículas de baja simetría Ribosoma (7.5/11.5 Å) Matadeen et al. (1999) Structure 7, 1575- 1583 Gabashvili et al. (2000) Cell 100, 537-549 U1 snRNP (10 Å) Stark et al. (2001) Nature 409, 539-541

56 Introducción a la tomografía tridimensional Los ángulos de Euler son interpretables como un sistema de coordenadas solidario a la partícula

57 Introducción a la tomografía tridimensional Reconstrucción del especimen medio (una sola imagen por especimen antes de su “destrucción”) Ruido traslacional, angular y en las imágenes (SNR

58 Blobs I n (x): Función de Bessel de primera especie modificada J n (x): Función de Bessel de primera especie

59 Blobs

60 ART Solución Inicial (1) (2) (3)

61 ART (1) (2) (3)

62 Blobs y FOMs

63 Optimización del blob y la rejilla

64 FOMs

65 FOMs

66 FOMs

67 FOMs dterr

68 FOMs

69 Optimización del proceso de reconstrucción Selección estadística de parámetros FOM max El máximo se encuentra en algún punto de este intervalo ANOVA y regresión no lineal pueden ayudar a establecer modelos

70 Combinación de FOMs Clasificación Análisis de Componentes Principales (PCA) Representante de grupo

71 Optimización del proceso de reconstrucción Reducción del volumen reconstruido 1.Implicaciones en velocidad 2.Implicaciones en la “determinación” del sistema r

72 Optimización del proceso de reconstrucción Orden de las proyecciones - Proyectar Retroproyectar x (k)... Iterar (n veces)

73 Normalización de imágenes Gradiente local dentro de la micrografía Restar el plano de fondo Diferentes intensidades en las proyecciones Normalización

74 Normalización y Positividad Datos originalesResultado (+)  n es constante (+) Se elimina la dependencia con la transformación lineal (+) Se pueden aplicar restricciones de positividad al volumen (-) Puede depender de fuertes variaciones del desenfoque del microscopio

75 Normalización

76 Normalización Microscopio Transformación lineal Digitalización Corrección CTF Normalización Log

77 Normalización Microscopio: De densidad de potencial a negativo de película Vars: Dureza del haz, tiempo de exposición, desenfoque, calidad de la película Revelado: De negativo de película a densidades ópticas Vars: concentración de los reveladores, tiempo de revelado Digitalización: De densidades ópticas a transmitancia Vars: no. of bits, global calibration, integration time Correcciones: Logaritmo Vars: no. de bits Normalización Vars: método

78 Normalización Los momentos de las proyecciones, salvo la media, de un objeto no tienen por qué coincidir A B

79 Normalización

80 CTF

81 Mejorando la resolución: la magia de los FEG Cañón termoiónico de WField Emission Gun 32 Å 18 Å

82 originalFEGcañón termoiónico de W Mejorando la resolución: efecto de la CTF

83 J. Frank CRC Press 1996 Corrección de la función de transferencia del microscopio Función de transferencia

84 CTF Las ondas dispersadas llevan menor potencia que las no dispersadas WPO

85 CTF Aberración esférica: Variación de desenfoque en función de la distancia al centro de la lente. Cs=1..5mm Aberración cromática: Variación de la velocidad de los electrones por inestabilidad de la tensión de aceleración. Ca Coherencia temporal: Dispersión energética de los electrones.  U/U=2eV

86 CTF Estabilidad de la lente: Variación de la corriente de la lente  I/I

87 CTF Desplazamiento mecánico transversal: en el plano focal por fenómenos electrostáticos.  R Desplazamiento mecánico longitudinal: perpendicular al plano focal.  F

88 CTF Astigmatismo: focalización asimétrica del haz.  f m,  f M y  Diámetro angular: diafragma metálico de radio R A

89 Modelado AR (Auto-Regresivo) y ARMA (Autoregresivo, Media Móvil) ESTIMACIÓN ESPECTRAL : Se considera el ruido como un proceso aleatorio cuya potencia espectral hay que determinar. Modelo AR Modelo ARMA

90 Determinación de los coeficientes ARMA Procedimiento propuesto por Kashyap (1984) ¶ Selección de las regiones de soporte N1, N2, N3 N1 N2 N3 = Son las regiones cuya información se tendrá en cuenta para determinación del ARMA (deben ser simétricas)

91 Determinación de los coeficientes ARMA · Solución de las Ecuaciones de Yule - Walker para determinar los coeficientes AR ¸ Solución de la ecuación de autocorrelación en el pixel considerado para determinar la varianza del ruido 

92 Determinación de los coeficientes ARMA ¹ Determinación de los coeficientes ARMA resolviendo las ecuaciones de Yule-Walker en la región de soporte N2 º Realización del filtro ARMA sobre una imagen de ruido blanco de media 0 y varianza 1 FFT inversa

93 ¿Cuál de los modelos ARMA se ajusta más a la CTF original ? MA

94 ARMA Promediado periodogramas ARMA

95 Fases del ajuste

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98

99 Resultado del ajuste

100 CTF de cada partícula

101 Experimento con IDR Phantom

102 Experimento con IDR Reconstrucción sin corrección de CTF

103 Experimento con IDR Reconstrucción con corrección de fase

104 Experimento con IDR Reconstrucción con corrección de amplitud

105 A priori

106 Simetría

107 Simetría

108 Simetría 15106

109 Crio-ME: PRD1 en diferentes estados de ensamblaje 25 Å 14 Å 12 Å

110 Adenovirus humano (wt)

111 Adenovirus humano: polipéptido IX Stewart, P. L., et al. 1993. EMBO J. 12:2589-99 Ad2: EM wt -Xray Ad5: EM wt -EM dl313

112 Sombreado metálico (-) Altura desconocida Restricciones volumétricas

113 Imagen tipo proporcionada por el microscopio de fuerzas atómicas

114 Restricciones volumétricas Corte a lo largo de Y Datos reales: policabeza del bacteriófago T4

115 Alineamiento de superficie Determinación de la superficie con 2 o 4 Å

116 Restricciones volumétricas Bioquímicamente se conoce el peso de las estructuras bajo estudio. Masa conocida

117 Restricciones volumétricas

118 Cristales

119 Reconstrucción de cristales

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126 Teorema de la sección central A)Objeto 3D B)Proyección de A C)Transformada de Fourier 2D de B D)C es una sección de la transformada de Fourier 3D de A: Sección central.

127 Transformada de Fourier 3D de un cristal 2D TF de una proyección de cristal 2D La información estructural se organiza A lo largo de una línea en el espacio Combinación de secciones centrales Líneas de red a lo largo de Z*.

128 Análisis de cristales 2D Imagen Original Transformada De Fourier Extracción de Componentes De Fourier Síntesis

129 Efecto del proceso de “Unbending”: Mapa de distorsión Antes de unbending Después de unbending

130 Efecto del proceso de “unbending” Antes de unbending Después de unbending

131 Interpolación en la líneas de red Para aplicar la TF -1 3D las líneas deben estar muestreadas uniformemente Cono perdido Cono perdido

132 Reconstrucción de cristales Sin ruido MRC, 49 imgs ART, 49 imgs MRC, 97 imgs ART, 97 imgs

133 Reconstrucción de cristales Con ruido MRC, 13 imgs ART, 13 imgs MRC, 49 imgs ART, 49 imgs

134 Reconstrucción de cristales

135

136 Reconstrucción MRCReconstrucción ART Phi29

137 Reconstrucción de cristales Reconstrucción MRCReconstrucción ART Policabeza del bacteriófago T4

138 Reconstrucción de cristales Policabeza del bacteriófago T4 ART

139 Reconstrucción de cristales Policabeza del bacteriófago T4 MRC

140 Reconstrucción de cristales Policabeza del bacteriófago T4

141 Resultados

142 Optimización de parámetros ART Frecuencia máxima del ruido: 0.2, 0.5 Nº ecuaciones/incógnita: 50, 130, 210 Blob: r=2, m=2, a=2,  =10.4, g=sqrt(2) Nº iteraciones:1 Distribución angular:Uniforme Phantoms:Dobles cilindros aleatorios SNR:

143 Optimización ARMA

144 Optimización IDR

145 Optimización Superficie

146 Reconstrucción phantom simple

147 Reconstrucción bacteriorodopsina

148 Antígeno T SV40. 1400 imágenes WBP

149 La misma reconstrucción aplicando ART y las ideas expuestas en esta tesis

150 Reconstrucción de partículas individuales Antígeno T de SV40

151 Algunos planos WBP ART

152 WBP ART Algunos planos

153 Dos planos de LAT

154 Dos planos del phantom de PDB

155 Reconstrucción de virus Adenovirus humano

156 Reconstrucción de virus Adenovirus humano