1 Alteraciones Combinadas de la HemostasiaSoledad Barrionuevo – Romina Volcovich Hospital de Pediatría JP Garrahan Año 2009

2 Introducción

3 Inhibidores adquiridos de la coagulaciónSustancias endógenas que afectan una o varias etapas de la cascada de coagulación, prolongando in vitro las pruebas correspondientes. Inhiben específicamente algún factor Interfieren en uno o varios pasos de la cascada INHIBIDORES ESPECÍFICOS INHIBIDORES NO ESPECÍFICOS o DE INTERFERENCIA ANTICUERPOS ANTI-FACTOR Neutralizantes [sitio activo  inh f(x)] NO neutralizantes Ac anti FosfoLípidos Paraproteínas PDF/pdf Heparina/Heparinoides

4 Anticuerpos Anti-Fosfolípidos¿Qué son? Los Ac anti-FosfoLípidos (aFL) son una familia de auto y aloAc de amplio rango de especificidades y de afinidades, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. ¿Cuáles son? Ac aFL Grupo a) aCardiolipina (CL) a[CL-b2gpI] ab2gpI, aII, aAnexina V, Proteína C Grupo b) Anticoagulantes Lúpicos (AL)

5 Anticuerpos Anti-Fosfolípidos¿Cómo se detectan? Los del Grupo a) se estudian mediante inmunoensayos. En cambio los del Grupo b) son detectados por prolongación, in vitro, de los tiempos de coagulación dependientes de FLs. ¿En qué circunstancias aparecen? Síndrome Anti-Fosfolipídico Enfermedades Autoinmunes  ej: LES (1/3 pacientes) Afecciones Malignas Enfermedades Infecciosas (transitoriamente) Drogas Individuos Jóvenes SANOS  Ancianos 2-10% AL (raramente juntos) 5-19% aCL

6 Anticoagulante LúpicoDefinido en 1983 como “un anticoagulante que prolonga el tiempo de cefalina activada y a veces el Tiempo de Quick de un plasma, pero que no inactiva de modo específico ninguno de los factores de coagulación conocidos”. Pertenece al heterogéneo grupo de los Ac aFLs, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. In vitro es detectado porque prolonga las pruebas de coagulación dependientes de FLs.

7 Anticoagulante LúpicoFosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Levine JS et al., 2002 NEJM

8 Anticoagulante LúpicoDefinido en 1983 como “un anticoagulante que prolonga el tiempo de cefalina activada y a veces el Tiempo de Quick de un plasma, pero que no inactiva de modo específico ninguno de los factores de coagulación conocidos”. Pertenece al heterogéneo grupo de los Ac aFLs, dirigidos contra proteínas con afinidad por la superficie aniónica de los fosfolípidos. In vitro es detectado porque prolonga las pruebas de coagulación dependientes de FLs. In vivo, su presencia se asocia con elevado riesgo de trombosis venosa o arterial (1963, Bowie et al) y con morbilidad fetal (1980, Zapato y Boffa).

9 Patogénesis de la TROMBOSIS asociada a Acs aFLTeorías: Activación de células endoteliales Injuria oxidativa del endotelio vascular Potenciación de la activación plaquetaria Modulación o interferencia con las f(x) regulatorias de la coagulación de  Proteínas Unidoras de FL  ej: b2gpI II, Proteína C, anexina V, Ft. Levine JS et al., 2002 NEJM

10 Anticoagulante LúpicoSu presencia NO siempre es patológica. El AL puede ser encontrado: como hallazgo de laboratorio en individuos asintomáticos en pacientes con clínica de trombosis o pérdidas fetales raras veces en pacientes con manifestaciones hemorrágicas SAF

11 Síndrome Anti-FosfolipídicoCriterios para llegar a su Diagnóstico (Consenso Sapporo revisado en Miyakis et al, 2006, J Thromb Haemost - ): En 2 o más ocasiones separadas x >12 sem Conte A. et al., 2008, Acta Bioquím Clín Latinoam

12 Caso Clínico

13 TP: 22 % aPTT: 124 seg AST: 475 UI/L ALT: 655 UI/LPaciente femenino de 11 años. Sin antecedentes de importancia, comienza con dolor abdominal y macrohematuria a fines de agosto de 2008 y consulta al Htal. Vicente López: se detecta leucocituria y hematuria con urocultivo negativo, por persistencia del cuadro se trata con antibiótico. Se suman vómitos y decaimiento: se procede a la internación por deshidratación 2º a vómitos. La paciente presenta además epistaxis. Se solicita laboratorio inicial. TP: 22 % aPTT: 124 seg AST: 475 UI/L ALT: 655 UI/L Se realiza transfusión con plasma, se coloca una dosis de vit K y con diagnóstico de Insuficiencia Hepática se deriva al Htal. Garrahan.

14 07-09-2008: 1º Consulta Htal. GarrahanExamen físico: Regular estado general-afebril-asténica-adinámica Pálida-no ictérica Abdomen depresible sin hepatomegalia Hematomas en sitios de punción Laboratorio inicial ( ): Hb: 11.4 g/dL Leucocitos: 6170 /mm3 (Fla. Normal) Hto: % Plaquetas: /mm3 TP: 50% aPTT: 83 seg Urea: 14 mg/dL Creatinina: 0.49 mg/dL AST: 272 UI/L FAL: 719 UI/L Suero anictérico ALT: 486 UI/L GGT: 49 UI/L Orina Completa: 0-1 leucocito/cpo 25-30 hematíes/cpo

15 Se indica vit K y comienza estudio de la coagulopatíaInterconsultas HEPATOLOGÍA HEMATOLOGÍA Insuficiencia hepática de etiología desconocida Alteración de la coagulación + Hepatitis infecciosa? Hepatitis autoinmune? Enfermedad de Wilson? Ecografía abdominal Ceruloplasmina/Cupruria/cupremia HAV HBV HCV EBV CMV ANA ASMA anti-actina anti-LKM Laboratorio de Hemostasia TP: 44 % aPTT: 90 seg Plaquetas: /mm3 Fibrinógeno: 415 mg/dL Factor V: 82% (VR: %) Hepatopatía? Se indica vit K y comienza estudio de la coagulopatía

16 Laboratorio de Hemostasia Estudio de TP y aPTT prolongados TP: 44 % VR: % aPTT: 88 seg VR: seg TT: 25 seg Normal: 23 seg Plaquetas: /mm3 Estudio de Mezclas evaluar la corrección del plasma del paciente con plasma normal en proporción 1:1 P + N Paciente Mezcla Pool Interpretación Criterio de corrección CORRIGE NO CORRIGE TP: valor teórico de mezcla aPTT: Índice de Rosner

17 Indice de Rosner (P+N) - NEstudio de Mezclas TP CORRIGE N+P 2 = 75 % P + N N 180 seg 37 seg 75 % 107 % P aPTT 88 seg TP 44 % = 162 % P Indice de Rosner (P+N) - N X 100 = > 10% aPTT NO CORRIGE Efecto COFACTOR

18 ANTICOAGULANTE LÚPICOHasta ahora… TP bajo CORRIGE aPTT prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Inh. Específico Neutralizante? Anticoagulante Lúpico? Con TT normal se descarta presencia de heparina DOSAJE DE FACTORES DETECCIÓN DE ANTICOAGULANTE LÚPICO

19 ANTICOAGULANTE LÚPICOHasta ahora… TP bajo CORRIGE aPTT prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Inh. Específico Neutralizante? Anticoagulante Lúpico? Con TT normal se descarta presencia de heparina DOSAJE DE FACTORES DETECCIÓN DE ANTICOAGULANTE LÚPICO

20 Laboratorio de HemostasiaAlgoritmo consenso para detección de Anticoagulante Lúpico 1º SCREENING Realizar 2 pruebas dptes de PL y que alguna sea prolongada. Recomendadas: DRVVT y aPTT sensible 2º CORRECCIÓN Verificar ausencia de corrección de las mismas pruebas con plasma normal. Pool de plasmas normales: in-house, 100% actividad, -70ºC 3º CONFIRMACIÓN Demostrar acortamiento de las mismas pruebas por neutralización con PL. Fosfolípidos hexagonales: más reproducibles que lisados de plaq. DETECTAR OTRAS COAGULOPATÍAS Frente a tests confirmatorios negativos o cuando hay sospecha de otra alteración además de la presencia de anticoagulante lúpico. Pengo et al., 2009 Thromb Haemost

21 Laboratorio de HemostasiaAlgoritmo para detección de Anticoagulante Lúpico SCREENING 1) DRVVT: 75 seg 2) PTT-LA: 83 seg 2 pruebas positivas CORRECCIÓN P + N N 109 seg 31 seg 116 seg 39 seg P DRVVT 75 seg aPTT 83 seg las mismas pruebas NO CORRIGEN CONFIRMACIÓN Prueba de Neutralización con Plaquetas (PNP) Criterio de positividad: INDICE DE CORRECCIÓN = P/N basal – P/N con plaquetas P/N basal > 10% X 100

22 Laboratorio de HemostasiaAlgoritmo para detección de Anticoagulante Lúpico CONFIRMACIÓN Prueba de Neutralización con Plaquetas (PNP) Criterio de positividad: INDICE DE CORRECCIÓN = P/N basal – P/N con plaquetas P/N basal > 10% X 100 basal aPTT pac 83 seg aPTT pool 39 seg DRVVT pool DRVVT pac + plaq 75 seg 33 seg 60 seg 40 seg 50 seg 32 seg IC = 29.5 las mismas pruebas se acortan con PL IC = 32.0 Los resultados anteriores son compatibles con la PRESENCIA DE ANTICOAGULANTE LÚPICO

23 Con TT normal se descarta presencia de heparinaTP bajo CORRIGE aPTT prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Con TT normal se descarta presencia de heparina Inh. Específico Neutralizante? Presencia de Anticoagulante Lúpico DOSAJE DE FACTORES

24 Con TT normal se descarta presencia de heparinaTP bajo CORRIGE aPTT prolongado NO CORRIGE Hepatopatía? Déficit de vit K? Déficit de factor? Inh. Específico NO Neutralizante? Con TT normal se descarta presencia de heparina Inh. Específico Neutralizante? Presencia de Anticoagulante Lúpico DOSAJE DE FACTORES

25 Laboratorio de HemostasiaDosaje de factores Vía Intrínseca XII 1% XI 1% IX < 1% VIII < 1 % VR: % Vía Extrínseca II 9 % V 69 % VII 77 % X 53% VR: %  en relación al resto Interferencia por AL! Alternativas: M. Cromogénicos M. Inmunológicos + clínica de sangrado TP bajo que CORRIGE DÉFICIT DE FACTOR II?

26 Laboratorio de Hemostasia Dosaje de Factor II (protrombina)Método Factor II (%) Coagulométrico 9 Cromogénico 7 Inmunológico 8 Existe baja actividad de protrombina por baja cantidad de factor circulante HIPOPROTROMBINEMIA CONFIRMADA

27 ANTICOAGULANTE LÚPICOclínica de sangrado sin antecedentes 11 años ANTICOAGULANTE LÚPICO HIPOPROTROMBINEMIA Fuerte sospecha de SÍNDROME DE ANTICOAGULANTE LÚPICO - HIPOPROTROMBINEMIA (LA-HPS)

28 Síndrome de Anticoagulante Lúpico - Hipoprotrombinemia (LA-HPS)Descripto por 1º vez en 1960 por Rapaport et al en una niña de 11 años con LES y sangrado severo. Es una enfermedad poco frecuente, más común en pediatría y en mujeres. Puede presentarse: como 1º manifestación o complicación de una patología autoinmune, asociado a infecciones virales transitorias y aún en individuos sanos. Mientras que el AL se asocia a elevado riesgo de trombosis, paradójicamente los pacientes con LA-HPS presentan riesgo de hemorragia severa cuando el déficit de II es marcado.

29 ¿Cuál es el mecanismo de hipoII en el LA-HPS?Bajaj et al demostraron en 1983 que el plasma de pacientes con AL y severa hipoprotrombinemia contiene ANTICUERPOS ANTI-PROTROMBINA NO NEUTRALIZANTES se unen a la protrombina pero NO INHIBEN su conversión a trombina Postularon y aportaron evidencia de que estos anticuerpos actúan formando complejos Ag-Ac que son rápidamente depurados por el sistema monocítico macrofágico generando una disminución de factor II circulante (déficit adquirido). TRATAMIENTO: glucocorticoides para reducir el clearence Ag-Ac.

30 ¿Cómo se demuestra la presencia de anticuerpos no neutralizantes?ELISA in house p-nitro-fenil-fosfato (450nm) anti IgG/M humana-FAL SUERO PROTROMBINA purif. comercial Se informa como Relación de Positividad (RP) respecto al cutt-off Cutt-off = percentilo 99 de 50 sueros normales Controles positivo y negativo (no hay calibrador) Resultados del paciente: RP IgG = 27  POSITIVO RP IgM = 1

31 ANTICOAGULANTE LÚPICOclínica de sangrado sin antecedentes 11 años ANTICOAGULANTE LÚPICO HIPOPROTROMBINEMIA Acs. ANTI-PROTROMBINA NO NEUTRALIZANTES Diagnóstico de SÍNDROME DE ANTICOAGULANTE LÚPICO HIPOPROTROMBINEMIA (LA-HPS) Prednisona VO por riesgo de sangrado SOSPECHA DE PATOLOGÍA AUTOIMNUNE

32 REUMATOLOGÍA Sospecha de LES Control: Hematología y ReumatologíaEvaluaron los siguientes resultados: Lab. Hematología: Hb: g/dL Leucocitos: /mm3 Hto: 34.4 % Eritrosedimentación: > 120 mm/hora Lab. Hemostasia y Trombosis: TP: 54% Presencia de anticoagulante lúpico aPTT: 79 seg Acs. anti-2GPI: positivo Plaquetas: /mm3 Acs. anti-cardiolipina: positivo Lab. Serología: Lab. Inmunología Humoral: VDRL: positivo Acs. anti-nucleares: positivo (+++) (interferencia) título: 1: 500 patrón moteado grueso Lab. Hemoterapia: Acs. anti-músculo liso: positivo Coombs directa: positivo Acs. anti-actina: negativo Acs. anti-LKM: negativo Proteinograma sérico: Acs. anti-DNA: negativo Alb C3: 38 mg/dL (98-150mg/dL)  C4: 3 mg/dL (15-30mg/d)    zona 2  PT 7.9 Sospecha de LES Control: Hematología y Reumatología

33 EVOLUCIÓN Laboratorio 1º control post-tto 21-10-2008Hb: 13.1 g/dL Leucocitos: 7600 /mm3 (Fla. Normal) Hto: 39 % Plaquetas: /mm3 TP: 88% Factor V: 132% A. Lúpico persitente aPTT: 42 seg Factor II: 37% Acs. Anti-II IgG RP: 18 TT: 23 seg Fibrinógeno: 292mg/dL Urea: 50 mg/dL Acs. Anti-nucleares: positivo 1:1000 moteado grueso Creatinina: 0.48 mg/dL Acs. DNA: negativo C3: 52mg/dL (98-150mg/dL) C4: 15mg/dL (15-30mg/dL) AST: 31 UI/L ALT: 43 UI/L GGT: 37 UI/L

34 El LA-HPS fue una manifestación precoz del LES.EVOLUCIÓN Enero 2009: Internación por fiebre y poliartralgias = Reactivación del LES Marzo 2009: Proteinuria significativa y punción bx. Renal = Glomerulonefritis Lúpica Proliferativa Mesangial Mayo de 2009: Dolor lumbar y aplastamiento vertebral = microfracturas por corticoterapia prolongada Actualmente: Tratamiento ambulatorio con prednisona, hidroxicloroquina y enalapril, bajo control por los servicios de Hematología, Reumatología, Nefrología y Patología Espinal. El LA-HPS fue una manifestación precoz del LES.

35 Discusión

36 Síndrome de AL-HipoProtrombinemiaSe han encontrado pacientes con AL y Ac anti-II Positivos que NO manifiestan una hipo-protrombinemia severa  éstos serían Ac de Baja Afinidad (Fleck et al, 1988). El tratamiento estaría indicado en pacientes con hipoProtrombinemia severa * que presenten manifestaciones hemorrágicas, y * en aquellos pacientes asintomáticos que deban ser sometidos a cirugía (ejemplo: Chung et al, 2008). El seguimiento cercano de los pacientes con LA-HPS es crucial, porque aunque tengan tendencia al sangrado, podrían desarrollar trombosis asociadas a la presencia del AL circulante (Chung et al, 2008).

37 Síndrome de AL-HipoProtrombinemiaUna hipo-Protrombinemia severa en un paciente con LA-HPS puede comprometer la Sensibilidad de algunas pruebas confirmatorias de AL  El ensayo Staclot-LA (Stago) sería, por su diseño, el menos afectado (Baca et al, 2002) Staclot-LA (Stago) Tubo 1 Tubo 2 Plasma Paciente X Buffer FL hexagonales Mezclar e incubar a 37°C Plasma Humano Normal Cefalina Activada Ca2+ y Largar cronómetro

38 Conclusiones

39 Anticoagulante LúpicoEl denominado AL es un conjunto heterogéneo de Ac dirigidos contra proteínas con afinidad por FL aniónicos, que interfieren in vitro con las reacciones de coagulación dependientes de FLs, prolongando las pruebas de APTT, KCT, dPT, dRVVT (sensibles por emplear baja CC de FLs). In vivo, el AL puede ser un hallazgo de laboratorio, y raras veces ser encontrado en pacientes con manifestaciones hemorrágicas (siempre asociado a trombocitopenia o hipoprotrombinemia severa concomitante). Sin embargo su presencia persistente se asocia con un aumento del riesgo trombótico, y se lo encuentra con mayor frecuencia en pacientes con trombosis venosa o arterial, o mujeres con complicaciones obstétricas o partos prematuros. Por lo tanto, su persistencia debe ser controlada 12 semanas después de su primera detección, realizando paralelamente la búsqueda de Ac antiFL (aCL y ab2gpI) por métodos inmunológicos para identificar a los pacientes con elevado riesgo de trombosis.

40 Anticoagulante LúpicoEl AL puede ser uno de los constituyentes de una alteración combinada de la hemostasia, de la cual pueden hacernos sospechar * una alteración simultánea de APTT y TP, * correcciones parciales en estudios de mezclas, y * que el paciente presente manifestaciones de sangrado.

41 Síndrome de AL-HipoProtrombinemiaEl LA-HPS es uno de los pocos cuadros clínicos en los que el AL es hallado persistentemente en pacientes con manifestaciones de sangrado, las cuales se deben a la presencia de Ac anti-Protrombina No Neutralizantes que aumentan el Clearence del factor II provocando un estado de hipo-Protrombinemia. En el caso clínico descripto, el LA-HPS fue la primera manifestación de una enfermedad autoinmune sistémica de la que inicialmente no había presunción clínica, y hacia la que orientaron los resultados del estudio de hemostasia. Aunque aún no se han reportado eventos trombóticos asociados a este síndrome, la presencia persistente del AL determina que estos pacientes estén en riesgo de desarrollarlos, por lo que es esencial seguirlos de cerca.

42 Bibliografía Pengo V, Tripodi A, Reber G, Rand JH, Ortel TL, Galli M, de Groot PG. Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. J Thromb Haemost 2009; 7: 1737–40. Levine JS, Ware Branch D, Rauch J. The Antiphospholipid Syndrome. N Engl J Med 2002; 346 (10): Miyakis S, Lockshin MD, Atsumi T, Branch DW, Brey RL, Cervera R, Derksen RHWM, de Groot PG, Koike T, Meroni PL, Reber G, Shoenfeld Y, Tincani A, Vlachoyiannopoulos PG, Krilis SA. International consensus statement on an update of the classification criteria for definite antiphospholipid syndrome (APS). J Thromb Haemost 2006; 4: 295–306. Conte A, Cadoudal N, Siguret V. Síndrome de anticuerpos antifosfolípidos. Acta Bioquím Clín Latinoam 2008; 42 (2): Fleck RA, Rapaport SI, L. Vijaya Mohan Rao. Anti-Prothrombin Antibodies and the Lupus Anticoagulant. Blood 1988; 72: Vivaldi P, Rossetti G, Galli M, Finazzi G. Severe bleeeding due to acquired hypoprothrombinemia-lupus Anticoagulant syndrome. Case report and review of Literature. Haematologica 1997; 82: Galli M, Barbui T. Antiprothrombin Antibodies: Detection and Clinical Significance in the Antiphospholipid Syndrome. Blood 1999; 93: Baca V, Montiel G, Meillón L, Pizzuto J, Catalán T, Shum LJ, Nieva B. Diagnosis of Lupus Anticoagulant in the Lupus Anticoagulant-Hypoprothrombinemia Syndrome: Report of Two Cases and Review of the Literature. American Journal of Hematology 2002; 71:200–207. Chung CH, Park CY. Lupus anticoagulant-hypoprothrombinemia in healthy adult. The Korean Journal of Internal Medicine 2008; 23:

43 Agradecimientos Lab. de Hemostasia y Trombosis Hospital GarrahanDras. Mirta Hepner, Graciela Pieroni y Eliana Annetta Compañeras de Residencia y Becarios Bioquímicos y técnicos del hospital

44 MUCHAS GRACIAS!!!