1 Análisis de corrientes registradas en inside out patch clamp de cilios de células receptoras olfatorias de Caudiververa caudiververa Tomados por Ricardo Delgado el 30 sep 2004 y el 17 oct 2002 Osvaldo Alvarez 3 de diciembre de 2007 Buscando canales ce cloruro activados por Ca 2+

2 04930023.dat, -30 mV, 10,000 pps -30 mV NMG-Cl 110 mM Ca 2+ 0.34  m.

3 04930023.dat Filtro Gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca.

4 Filtro Gauss 8 polos, low pass 100 Hz Si se usa un umbral puesto al 50% del salto de corriente, se dejan de ver los eventos más cortos que 3 ms. 5 ms1 ms

5 04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV Filtro Gauss 8 polos, hi pass 1 Hz, Cursor 1 a 2. Zona 0

6 S. D. = 0.15 pA Zona 0 Límite de detección de las transiciones de la corriente: Amplitud: 0.15 pA (5 pS @ 30mV) Duración 3 ms.

7 04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca. Zona 1

8 1.43 pA 1.32 pA 1.84 04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca. Zona 1 zoom Cerrados

9 04930023.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 0.34 um Ca. Zona 2

10 f=a1*exp(-.5*((x-x1)/s1)^2)+a2*exp(-.5*((x-x2)/s2)^2) Param s.e. a10.09130.0020 a20.03710.0021 s10.30400.0085 s20.28940.0206 x1-0.39950.0081 x20.77580.0194 x2-x1=1.18  0.02 pA P(abierto)= 0.71 Cerrados Abiertos

11 04930027.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. Zona 2

12 04930027.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. Zona 2 zoom

13 04930027.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca.

14

15

16 Promedio t cerrado 19.6 ms

17 Promedio t abierto 20.9 ms Promedio t cerrado 19.6 ms Frecuencia promedio 25 Hz

18 Promedio t abierto 20.9 ms Promedio t cerrado 19.6 ms Resumen 9 min de análisis Resumen 18.3 s de análisis

19 04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid Zona 1

20 04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid Zona 1 zoom Cerrados Abiertos

21 2.12 pA Zona 1 04930029.dat Filtro gauss 8 polos, low pass 100 Hz -30 mV NMG-Cl 110 mM 3.51 um Ca. 20 um Niflumic acid

22 +10 mV 50 uM Ca 0 mV, 10 -7 M Ca +20 mV 50 uM Ca +30 mV 50 uM Ca 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

23 -30 mV 50 uM Ca +40 mV 50 uM Ca +50 mV 50 uM Ca 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

24 -70 mV 50 uM Ca -40 mV 50 uM Ca -60 mV 50 uM Ca -20 mV 50 uM Ca 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

25 -70 mV -60 mV -50 mV -40 mV 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

26 -30 mV -20 mV +10 mV +20 mV +30 mV 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

27 Curva roja canal selectivo para Cl -

28 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

29 ¿Y si fuera selectivo para Na + ? Curva roja canal selectivo para Na + 02O17015 al 02O17026 110 NMG-Cl / 10 NaCl

30 Análisis de ruido de corrientes macroscópicas. Determinación del número de canales y de la corriente unitaria y la probabilidad del abierto. Lecar, H., and F. Sachs. 1981. Membrane noise analysis. In Excitable Cells in Tissue Culture. P. G. Nelson and M. Lieberman, editors. Plenum Press, New York. 137-172. DeFelice, L. 1981. Introduction to Membrane Noise. Plenum Press, New York.

31 Para analizar los registros de las corrientes macroscópicas haremos un modelo que supone: 1) los canales tienen sólo dos estados: conducen o no conducen. 2) todos los canales son iguales. 3) no hay interacción entre los canales.

32 En membrana con un solo canal. La corriente para el canal cerrado es 0. La corriente para el canal abierto es i. La probabilidad de encontrar el canal abierto es p. La probabilidad de encontrar el canal cerrado es q. Según la primera suposición p + q = 1 La corriente promedio de la membrana será la suma de la corriente de cada estado multiplicada por la probabilidad de cada estado.

33 Para el caso de la membrana con un solo canal : La varianza de la corriente es la suma de las desviaciones de la corriente de cada estado con respecto a la corriente promedio, elevadas al cuadrado y multiplicadas por la probabilidad de cada estado.

34 Para la membrana con 1 canal Para una membrana con N canales Recordar que p + q =1 Es una parábola

35 Corriente promedio, pA Varianza, pA 2 i = 1 pA, N = 1,000

36 Es una parábolaEs una recta i iN

37 Análisis de la varianza y el promedio de corriente medida en cilios de células receptoras olfatorias. x d riri roro rmrm r i = resistencia del líquido intracelular por unidad de longitud de cilio ohm  m -1 d = longitud de cilio.  m r o = 0 =resistencia por unidad de longitud del medio extracelular. = constante de espacio,  m r m = 0 = resistencia de la membrana por unidad de longitud del cilio ohm  m. Larsson et al 1999 Biophys J. 72:1193-1203

38 d riri roro rmrm x V(0) g m = 1 /r m S  m -1 g o = conductancia de la membrana con todos los canales cerrados S  m -1 n = número de canales por unidad de longitud del cilio  m -1.  = conductancia de los canales S. p = probabilidad del estado abierto de los canales

39 p = 0 p = 1 n = 100  m -1  = 1 pS d = 30 o 60  m

40 p = 0 p = 1 n = 100  m -1  = 30 pS d = 30 o 60  m

41

42 i iN n100  m   1pS d1 mm V1V

43 i < iN n100  m   30pS d1 mm V1V

44

45 Larsson et al 1999 Biophys J. 72:1193-1203 i = 0.034 pA @ -40 mV  = 0.8 pS n = 26 canales por  m d = 50  m p = 0.61 @ Ca 2+ 300  M Rana pipiens.115/115 NaCl, 0.12 a 300  M Ca 2+ i

46

47 r(p) pA pA Curva negra Puntos rojos lim d>>

48 r(p) pA pA Curva negra Puntos rojos lim d>>

49 r(p) pA pA Curva negra Puntos rojos lim d>>

50 r(p) pA pA

51 r(p) pS pS r(p) pA pA i encontrada por Solver de Excel Curva roja

52 Diameter0.28um Lenght60um Area54.5um20.908um29.08um2 Area5.45E-07cm2 Capacitance5.45E-07uF9.08E-09uf9.08E-08uF 0.09pF Rinside11Mohm110Mohm 110Mohm Gmembrane5pS Rmembrane5.00E+12ohm5.00E+05Mohm 500Gohm Rm 200ohm cm23.67E+08ohm2.20E+10ohm Gsingle channel1.00E+01pS Rsingle channel1E+11ohm100000Mohm 100Gohm Larsson et al 1999 Biophys J. 72:1193-1203 Cilo entero 1  m 10  m 10  m

53 CanalNodoClamp

54 Tiempo, milisegundos Intensidad de corriente,pA Canal Clamp

55 Canal Clamp Intensidad de corriente, pA Tiempo, milisegundos

56 Canal Clamp Intensidad de corriente, pA Tiempo, milisegundos

57 Canal Clamp Intensidad de corriente. pA Tiempo, milisegundos

58 Canal Clamp Intensidad de corriente, pA Tiempo, milisegundos

59 Canal Clamp Intensidad de corriente Tiempo, milisegundos

60 Varianza promedio canal 2 a 6 4.70E-02 Varianza promedio clamp 2 a 6 0.80 E-02 Canal Clamp

61 Canal