1 Análisis de datos de alto rendimiento Con ejemplos de Partek Genomics Suite Alex Sánchez Unitat d’Estadística i Bioinformàtica (IRHUVH) Departament d’Estadística (UB)

2 Objetivos  Análisis de Datos de Alto Rendimiento Tipos de datos y Tipos de estudios. Herramientas disponibles.  Análisis de datos de microarrays El proceso de análisis Estudios de expresión diferencial con Partek GS  Otros tipos de estudios

3 High troughput data  Muchas técnicas modernas permiten generar información simultánea sobre miles de componentes de un sistema: High-troughput o de “alto rendimiento”  Por ejemplo Microarrays (expresión, SNPs, exones,…). Proteómica (Mass-Spectormetry). Next Generation Sequencing …

4 Análisis de datos de A.R.  Los datos de alto rendimiento, con las herramientas y los métodos apropiados, permiten llevar a cabo estudios que habrían sido impensables sin ellos.  Por ejemplo Selección de genes Busqueda de biomarcadores Estudios de asociación genética Detección de variantes víricas, etc.

5 Análisis de microarrays  Caso más conocido, “prototípico” de datos de A.R.  Tecnología madura (10 años) y diversificada (expresión, exones, tejidos, SNPs,….)  Con algunas limitaciones que las nuevas tecnologías podrán superar  EMPEZAREMOS por ellos.

6 Tipos de estudios que se realizan usando microarrays de DNA

7 (1): Class comparison

8 (2): Class discovery

9 (3): Class prediction

10 Y muchos más tipos …  Time Course Perfiles de expresión a lo largo del tiempo  Pathway Analysis-(Systems Biology) Reconstrucción de redes metabólicas a partir de datos de expressión  Whole Genome, CGH, Alternative Splicing  Estudios con datos de distintos tipos Fusión o Integración de datos

11 Herramientas para el análisis

12 Programas de análisis de datos de genómica y protómica  Multitud de herramientas Gratuítas / Comerciales [R, BRB, MeV, dChip…] / [Partek, GeneSpring, Ingenuity] Descargables / En-linea [R, BRB, MeV…] / [Gepas,…] Aísladas / Parte de “suites” o de sitios [BRB, dChip] / [MeV (TM4), OntoTools]  A survey of free microarray data analysis tools: http://chagall.med.cornell.edu/I2MT/MA-tools.pdf

13 Programas de análisis libres Programa  R/Bioconductor Potente, flexible, actualizado, Unix/Windows/Mac Consola, difícil de dominar BRB tools Basado en Excel, User-friendly Si falla, falla Difícil de extender dChip Expresión & SNP’s User-friedly Solo Windows Pocas opciones GEPAS Web-based, Multiples opciones, Buen material Web-based Manejo algo rígido …

14 Programas de análisis comerciales Programa  geneSpring Muy extendido Graficos potentes Extensible (R) Modelos de ANOVA limitados CARO Partek ANOVA muy potente Mult. tipos de datos Visualización 3D Sólo estadística “clásica” Difícil de extender Ingenuity BD de anotaciónes Análisis de significación biológica Centrada mayormente en datos de cáncer …

15 Experimentos con microarrays

16 Visión general del proceso (Affy) @Affymetrix

17 Otra perspectiva general

18 El proceso de análisis

19 Workflow for a typical microarray experiment (1) Imágenes (Datos crudos) (2) C. de calidad (bajo nivel) (3) Preprocesado (4) Exploración de la Matriz de Expresión (5) Análisis (6) Significación Biológica

20 (1) Obtención de la imagen Entra: Microarrays Salen: – Imágenes (1/chip) – Ficheros (.CEL,.CHP) Información para cada sonda individual Datos para el análisis de bajo nivel – Control de calidad – Preprocesado – Sumarización … … 1.cel, 1.chp2.cel, 2.chp

21 (2) Control de calidad de bajo nivel Entra: – Imágenes (.CEL) Proceso – Diagnósticos y Control de calidad – Análisis basado en modelos (PLM) Salen: – Gráficos – Estadísticos de Affymetrix … 1.cel, 1.chp2.cel, 2.chp

22 (3) Preprocesado Entra: – Fichero de Imagenes Proceso – Eliminación de ruido – Normalización – Sumarización – Filtrado Sale: – Matriz de expresión … 1.cel, 1.chp2.cel, 2.chp C01-001.CEL C02-001.CEL C03-001.CEL 1415670_at 8.954387 9.088924 8.833863 1415671_at 10.700876 10.639307 10.610953 1415672_at 10.377266 10.510106 10.461701 1415673_at 7.320335 7.252635 7.112313 1415674_a_at 8.381129 8.332256 8.393718 1415675_at 8.120937 8.082713 8.051514 1415676_a_at 10.322229 10.287371 10.282812 1415677_at 9.038344 8.979641 8.905711

23 (4) Exploración Entra – Matriz de expresión Proceso – PCA, Cluster, MDS – Representaciones en 2D/3D – Agrupaciones Sale – Detectado efectos batch – Verificación calidad C01-001.CEL C02-001.CEL C03-001.CEL 1415670_at 8.954387 9.088924 8.833863 1415671_at 10.700876 10.639307 10.610953 1415672_at 10.377266 10.510106 10.461701 1415673_at 7.320335 7.252635 7.112313 1415674_a_at 8.381129 8.332256 8.393718 1415675_at 8.120937 8.082713 8.051514 1415676_a_at 10.322229 10.287371 10.282812 1415677_at 9.038344 8.979641 8.905711

24 (5) Análisis estadístico Entra: – Matriz expresión – Modelo de análisis Proceso – t-tests, ANOVA Ajustes de p-valores Sale – Listas de genes Fold change, p.values – Gráficos – Perfiles de expresión C01-001.CEL C02-001.CEL C03-001.CEL 1415670_at 8.954387 9.088924 8.833863 1415671_at 10.700876 10.639307 10.610953 1415672_at 10.377266 10.510106 10.461701 1415673_at 7.320335 7.252635 7.112313 1415674_a_at 8.381129 8.332256 8.393718 1415675_at 8.120937 8.082713 8.051514 1415676_a_at 10.322229 10.287371 10.282812 1415677_at 9.038344 8.979641 8.905711

25 (6) Significación biologica Entra – Listas de genes Proceso – GEA, GSEA, … Sale: – Clases GO / Grupos de Genes Pathways especialmente representados

26 Estudio de casos

27 Caso 1 Comparación de perfiles de expresión en AML con trisomía 8 o citogenética normal

28 Descripción  PNAS, January 30, 2001 vol. 98 (3)  Objetivo: Comparar perfiles de expresión en enfermos de AML+8 con enfermos AML y individuos sanos.  No se dispone de información sobre el diseño experimental

29 Esquema del análisis 1.Datos para el análisis 1. 15 archivos.CEL (5 por grupo) 2.Control de calidad [Expression console] 3.Preprocesado [Partek] 4.Exploración [Partek] 5.ANOVA y selección de genes [Partek] 6.Significación Biológica [Partek]

30 2. Control de calidad (1) Descargar Expression Console de la web de Affymetrix affymetrix.com Instalarlo Iniciar Seleccionar archivos.CEL – Create New Study – Download library files – Add Intensity Files

31 2. Control de Calidad (2) Probe cell intensity view: Examen de las imágenes Una por chip Box plot – Absolute intensity – Relative intensity

32 2. Control de Calidad (3) Correlation plots – Pearson/Spearman – Signal/detection-p Box plot – Absolute intensity – Relative intensity

33 Control de Calidad (y 4): Métricas de CdC Scale Factor % Presence

34 Análisis de los datos con Partek  La suite genómica de Partek permite analizar datos de expresión Leer datos (.CELs o matriz de expresión) Explorar los datos (PCA/Cluster/MDS) Seleccionar los genes DE (ANOVA) Construccion de predictores  Análisis de otros tipos de datos Exon arrays, SNP arrays, Tiling, CGH …

35 Instalación de Partek  El IR dispone de una licencia flotante a la que puede conectarse un solo usuario cada vez.  Instalar el archivo setupPGS.6.08.0623-64Release.exe disponible en: \\servir3\recerca$Partek  Ejecutar el archivo  Se instala el programa  Al iniciar el programa por 1ª vez pide El tipo de licencia  “Floating License” Nombre del servidor  “servir1”

36 Lectura/Importación de los datos

37 (1) Seleccionar archivos.CEL  Seleccionar.CEL a importar  Pulsar 

38 (2) Definir parámetros importación

39 (3) Definir grupos y covariables (1)  A cada hoja de datos se le ha de asociar una lista de covariables Grupo al que pertenece cada muestra Informaciones clínicas, biométricas, etc  Puede prepararse a parte e importarlo o crearlo tras leer los datos.  http://www.partek.com/Tutorials/micr oarray/User_Guides/CreatingSampleI nfoFile.pdf

40 (3) Definir covariables (y 2)  Tools  Create Sample Info File  Seleccionar archivos CEL/CHP  Añadir las columnas necesarias  Definir el tipo de cada una  Tras llenar todas las columnas  Save file (.txt)  Combinar datos y covariables  Merge Spreadsheets  Grabar archivo resultante  Save (format file,.fmt)

41 Análisis de datos  Para facilitar el proceso de análisis  Workflows Itinerario sugerido desde los datos hasta los resultados finales Permite guardar y continuar en otro momento Existe un workflow para cada tipo de datos

42 Workflow (WF) de análisis de datos de expresión

43 WF (2.1): QA/QC. PCA PCA Visualizacion de los datos en 2D/3D Permite detectar efectos “fuera del diseño o del modelo” Cada eje explica un mayor % que el siguiente  Atención a la variabilidad total!!!

44 WF (2.2): QA/QC. Histogram

45 WF (3) Detect differentially expressed genes (DEG) 1.Seleccionar la(s) variable(s) para las que se desea realizar la comparación [Los factores del ANOVA] 2.Definir las comparaciones entre grupos [Los contrastes a efectuar] 3.Ejecutar el análisis

46 WF (3.1) Selección de factores Los factores representan las distintas fuentes de variación en los datos. Deben definirse como variables categoricas o “factor” al crear el archivo de covariables

47 WF (3.2) Contrastes Opción “Advanced” del dialogo ANOVA Los contrastes indican que comparaciones concretas (entre niveles de un factor) se desea llevar a cabo. Comparaciones individuales (Grupo 1-Grupo 2) o más complejas (Tr1+Tr2+Tr3)/3-Ctl

48 Para cada gen se obtiene los resultados de – Significación global – Significaciónn de cada contraste deseado De cada comparación obtenemos los p-valores y estadísticos de test solicitados (por ejemplo Fold Change, T-test,…) WF (3.3) Resultados

49 Como en todo ANOVA la variabilidad explicada debe ser mayor que el error. Muy útil si hay más de 2 factores y uno es un efecto Batch. WF (3.3) Sources of variation

50 El programa generará una tabla con el número de genes que se considerarían diferencialmente expresados asociados a un valor dado de FDR. WF (3.4) Multiple testing Para evitar problemas de “multiple testing” podemos fijar un valor de tasa de falsos positivos (FDR). – Stat  Multiple Test  False Discovery Rate (FDR)

51 WF (3.5) Create Gene Lists Para cada comparación realizada puede obtenerse una lista de genes seleccionados. A partir de las listas pueden hacerse gráficos diversos – Venn – Heatmaps

52 WF (4): Visualización Dada una lista de genes un heatmap permite visualizar patrones de expresión que pueden sugerir que ciertos grupos de genes se encuentran co- regulados.

53 WF (5) Biological significance  El programa permite realizar diversos tipos de análisis para ayudar a entender los procesos biológicos implicados Análisis de enriquecimiento sobre categorías de la Gene Ontology. Deteccion de categorias diferencialmente enriquecidas entre grupos experimentales. Enviar las listas de genes a Ingenuity.

54 WF (5.1) GO Enrichment

55 Resumen y Conclusiones  El análisis de microarrays puede visualizarse como un proceso.  Es importante conocer Los parámetros El significado, Las limitaciones de cada paso.  Una herramienta como Partek puede ayudar a seguir este proceso con relativa confianza.