1 ANALISIS DEL PERFIL DE PEQUEÑOS RNAs REGULADORES EN LA PATOGENESIS DE LA LEUCEMIA LINFOIDE CRONICA TESIS DE MAESTRÍA Lic. Soledad Marton Institut Pasteur de Montevideo

2 MicroRNAs  Pequeños RNAs de 21-25 nt  Transcriptos a partir de genes endógenos  Inhibidores post transcripcionales de la expresión génica Unión: al extremo 3' UTR mRNA blanco imperfecta

3 MiRNAs y cáncer o Gran parte de los genes de microRNA se encuentran en regiones génicas alteradas en cáncer (Ej miR15a-miR16-1 en región 13q14)‏ o El perfil de expresión de miRNAs está alterado en algunos canceres. o~ 20 to 30% de los genes humanos son regulados por miRNA (100-200 mRNA por miRNA)‏ “ANTITARGETS” Involved in basic processes common to all cells “ANTITARGETS” “TARGETS” Involved in develpmental timing, cell proliferation, apoptosis, metabolism, cell differentiation and morphogenesis “TARGETS” La selección positiva para evitar la regulación por microRNA divide a los mRNAs en dos grupos o A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):828-33. o MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005 Jun 9;435(7043):834-8.

4 oncogenes (Cluster miR- 17-92) ‏ Genes supresores de tumores (let-7 y miR15a y miR16) ‏ CANCER mRNA Oncogenes Familia RAS y Bcl-2 mRNA supresores de tumores FT pro-proliferativo/pro- apoptotico E2F1,en altas conc causa apoptosis microRNA  McManus & MorrisSlowing down the Ras lane: miRNAs as tumor suppressors? Sci STKE. 2005 Aug 16;2005(297):pe41. Review.  Kent OA, Mendell JT. AbstractA small piece in the cancer puzzle: microRNAs as tumor suppressors and oncogenes.  Oncogene. 2006 Oct 9;25(46):6188-96. Review.

5 Leucemia Linfoide Crónica Desorden acumulativo (¿proliferativo?) de linfocitos B Leucemia más frecuente en occidente Dos subgrupos : – Buen pronóstico (Ig Mutada)‏ – Mal pronóstico (Ig No Mutada)‏ Chiorazzi N, Rai KR, Ferrarini M.Chronic lymphocytic leukemia. N Engl J Med. 2005 Feb 24;352(8):804-15. Review

6 OBJETIVO GENERAL Comprensión de la biología de la LLC-B

7 Objetivo Específico 1) Análisis por clonado molecular del perfil de pequeños RNAs de células leucémicas de pacientes LLC-M y LLC-NM 43 (15%) ‏ 157 (55%) ‏ 28 (10%) ‏ 25 (8%) ‏ 4 (1.5%) ‏ 30 (10.5 %) ‏ 287 (100%) ‏ M 27 (11%) ‏ 132 (55.5%) ‏ 28 (12%) ‏ 28 (12%) ‏ 1 (0.5%) ‏ 21 (9%) ‏ 237 (100%) ‏ NM NDE RNAs estructu rales mRNA Transcriptos sentido/ant isentido no codificantes Posibles nuevos miRNAs conocido s Número total de secuencias clonadas

8 7p14.2 (-)80 U CU U -GCCA UC A G GCUA UC CCUGA UUCUGAGCC AAUC CUU C |||| || ||||| ||||||||| |||| ||| CGAU AG GGACU AGGACUUGG UUAG GAG C C -- - GUUUA -- A A CUCCUGAGCCAUUC UGAGCCUC (22) M-17 12q14.1 (+)100 C U U U UGU UGGC GAGGUAGUAGUUUGUGC GUU--------GG CGGGU G |||| ||||||||||||||||| ||| || ||||| AUCG-UUCCGUCAUCGAACGCG CAA UC-GCCCG A U UAGAGGUG UUA CUGCGCAAGCUACU GCCUUGC (21) ‏ M-64 14q11.2 (-)53 AC U UGAAAU UAAGUCC -GUU G UUU AGUUUGC-CA GA GCAUGU GU UCAG-CU A ||| ||||||| || || |||||| || |||| || AAA--UCAGACG GU-CU------CGUACA-------CA AGUC GA U A AAUU C C CCUGAUUAAACACA UGCUCUGA (22) ‏ M-84 17q21.32 (-)82 U C-C A G GCAG CA AGC U CCU CCGG GCCA GAU CU AGCCAC AGGGUG U ||| |||| |||| ||| || |||||| |||||| U GGA GGUC CGGU UUA----GA UCGGUG UCUCGC A CGU G G CC ACU G CCCGGAGCCAGGA UGCAGCUC (21) ‏ NM-84 6q25.3 (+)90 CUGCAGA UG A UG GA CU C CCUG GG CC GCU-GC--AG GGG GGCA GC A |||| || || ||| || || ||| |||| || GGAC CC GG CGACCG UC CUC CCGU--CG G AAGAA-- GU A AU CU AC G GUGCCAGCUGCAG UGGGGGAG (21) ‏ M-94 Localización (DNA strand) ‏ Hairpin score Predicted hairpin Cloned sequence (nt) miRNA Nuevos genes microRNAs (intrónicos) ‏

9 mRNAs con sitios de unión a los posibles microRNA

10 microRNAs clonados de las células LLC-B 1-let7i 3p a McMc NM b 2416 1315a 2-24 2-22 3-29a 3-26a 81142 3p -330d 4-142 5p 44150 3 3 -191 -155

11 Obj E 2) Análisis del perfil de expresión de miRNAs por northern blot en forma comparativa entre ambos grupos de células leucémicas y linfocitos B normales.  En general se observa una sub-expresión de los miRNAs en las células LLC-B en relación a los linfocitos B normales (no miR-155)‏  No estaba descripta la baja expresión en los miRNAs miR-181a, miR-30d and let-7a. Los bajos niveles de let-7a y miR-181a sugieren fenotipo indiferenciado en células LLC-B. No está claro que significa la baja expresión de miR-30d en las células LLC-B.

12 eGFP 5’ 3’ Pre-miR-181 miR-181 125 nt Obj E 3) Puesta a punto de sistema de expresión de microRNAs Plásmido pCMV modificado.

13 Transfecciones (transitorias) por electroporación de células Daudi y Jurkat DAUDI JURKAT Línea Celular 50303,5pCMV 60303pCMV-181a 41867,4pCMV-181a 82513,1pCMV Eficiencia %Viabilidad % Nº Total de celulas (x10 6 ) ‏ Construcción

14 Control 181-0 181-40 181-125 Expresión ectópica de miR-181a induce una disminución en el conteo celular Celulas transfectadas y cultivadas durante 15 días en presencia de neomicina

15 Perspectivas Validación de los miRNA “putativos” (RT-PCR) ‏ Verificacíon experimental de mRNA blancos de los miRNAs putativos Identificación de blancos de miRNA 181a (co transfección) ‏

16 FIN

17 Biogénesis ” MicroRNA function in animal development“ by Erno Wienholds and Ronald H.A. Plasterk, FEBS Letters, Vol 579, 5911-5922, Copyright 2005.

18 Direccionamiento de los mRNA blancos a los cuerpos P Zamore P D, H.B., Ribo-gnome: the big world of small RNAs. Science, 2005. 309(Review): p. 1519-24.

19 Obj E 1) Análisis del perfil de miRNA en LLC-M y LLC-NM Clonado de pequeños RNAs

20 Resultados del clonado molecular 43 (15%) ‏ 157 (55%) ‏ 28 (10%) ‏ 25 (8%) ‏ 4 (1.5%) ‏ 30 (10.5 %) ‏ 287 (100%) ‏ M b 27 (11%) ‏ 132 (55.5%) ‏ 28 (12%) ‏ 28 (12%) ‏ 1 (0.5%) ‏ 21 (9%) ‏ 237 (100%) ‏ NM a NDE f nc RNAs e mRNA Sens/antise ns non coding RNA transcripts d Putative novel miRNAs c Known miRNAs Total Number of Sequenced Clones

21 Objetivos Específicos Objetivo Específico 1) Análisis por clonado molecular del perfil de miRNA de células leucémicas de pacientes LLC-M y LLC-NM Objetivo Específico 2) Análisis del perfil de expresión de miRNAs por northern blot en forma comparativa entre ambos grupos de células leucémicas y linfocitos B normales.

22 Objetivo Específico 3) Puesta a punto de un sistema de expresión de microRNAs (líneas celulares de estirpe linfocitaria y linfocitos B leucémicos provenientes de pacientes). Analizar el efecto de la sobre-expresión de miRNA específicos en la fisiología celular y el fenotipo tumoral.