1 ANÁLISIS Y CUANTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOSReacción con o-ftalaldehído (Fluorimétrica) Reacción de la ninhidrina (espectrofotométrica) Cromatografía de intercambio catiónico Actualmente: HPLC

2 Cromatografía en capa fina (aminoácidos)

3 PURIFICACIÓN Y AISLAMIENTO DE PROTEÍNASSuspensión de Células ó tejidos: Ultrasonidos Detergente Émbolo rotatorio (potter ó aspas) Homogenado FRACCIONAMIENTO DEL HOMOGENADO CELULAR Centrifugación a baja velocidad Homogenado celular PRECIPITADO 1 Células enteras, núcleos, citoesqueleto Velocidad media 20000g, 20min 1000g, 10 min Velocidad alta 80000g, 1h Velocidad muy alta 150000g, 1h SOBRENADANTE 1 2 3 PRECIPITADO 2 mitocondrias, lisosomas, peroxisomas PRECIPITADO 3 Microsomas, otras vesículas pequeñas PRECIPITADO 4 Ribosomas,virus macromoléculas CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

4 CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICAFraccionamiento Muestra Gradiente de sacarosa Componente menos denso Componente mas denso

5 SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNASSe basa en la diferente: Solubilidad Tamaño Carga eléctrica Densidad Afinidad por otras moléculas

6 SEPARACIÓN DE PROTEÍNASCROMATOGRAFÍA EN COLUMNA Las diferentes proteínas se retrasan según sus interacciones con la matriz, de acuerdo a su carga, hidrofobicidad, tamaño o unión a grupos químicos Muestra aplicada El solvente se aplica contínuamente a la boca de la columna Matriz sólida Tapón poroso Tubo de ensayo tiempo Moléculas fraccionadas eluídas y recogidas

7 TRES CLASES DE CROMATOGRAFÍA EN COLUMNAA) Intercambio iónico: en base a la carga Depende del pH y de la fuerza iónica B) Filtración en gel: en base al tamaño C) de Afinidad: Flujo de solvente Partícula cargada positivamente Molécula cargada negativamente unida Molécula cargada positivamente libre Partículas porosas Molécula pequeña retrasada Molécula grande no retrasada Partícula con sustrato unido covalentemente Molécula de enzima unida Otras proteínas pasan de largo

8 A: CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (Ej: intercambio catiónico)Las proteínas se separan según su carga a un pH determinado

9 Las proteínas se separan según su tamañoB: CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN O EXCLUSIÓN MOLECULAR Las proteínas se separan según su tamaño

10 C: CROMATOGRAFÍA DE AFINIDADLas proteínas se separan en función de la especificidad de unión a un ligando. En este ejemplo el ligando es la glucosa y se separan aquellas proteínas que se unen a ella. Las proteínas de interés se eluyen añadiendo un exceso de ligando libre.

11 ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

12 ELECTROFORESIS EN GEL Electroforesis en SDS-PAGE (solubilizaTras aplicar un campo eléctrico las proteínas migran en función del tamaño y de la carga (solubiliza proteínas)

13

14 Ejemplo de análisis de proteínas por SDS-PAGE en cada paso de una purificación. En el último paso hay una única banda, lo que indica que tenemos la proteína de interés completamente purificada

15

16 ISOELECTROENFOQUE Es un tipo de electroforesis en gel con anfolitos que crean un gradiente de pH. Cada proteína migra hasta su punto isoeléctrico.

17 Ejemplo de SDS-PAGE teñido con azul de CoomassieMarcador de PM Marcador de PM

18 GELES BIDIMENSIONALES (2D)Primero isoelectroenfoque y luego SDS-PAGE

19 Ejemplo de gel bidimensional

20 SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNASSe basa en la diferente: Solubilidad Tamaño Carga eléctrica Densidad (centrifugación) Afinidad por otras moléculas

21 FRACCIONAMIENTO POR DISMINUCIÓN DE LA SOLUBILIDAD(p.e. sulfato de amonio) (Voet)

22 (Voet)