1 Anticuerpos monoclonales omalizumabBENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA Laboratorio de Medicamentos Biotecnológicos D.C. Rosa Elena Arroyo Carmona PRODUCCIÓN DE XOLARI OMALIZUMAB Aragón Duncan Héctor – Campero Romero Yuria Itzel – García Miranda Pilar Vianey – Jurado Becerra J. Ramón – Martínez Martínez Diana Gabriela

2 Omalizumab Los anticuerpos monoclonales son inmunoglobulinas que provienen de una sola línea celular 80s´el desarrollo de los anticuerpo monoclonales de murino Mecanismo de producción Antígeno de interés Uso en investigación Uso en terapia

3 Por lo general se inyecta una vez cada 2 o 4 semanas.Omalizumab se ha autorizado para el uso en asma alérgica severa y urticaria crónica. Por lo general se inyecta una vez cada 2 o 4 semanas. Una vez cada 4 semanas

4

5 Efectos secundarios Dolor, enrojecimiento, hinchazón, calor, ardor, moretones, endurecimiento, o picazón en el lugar donde se inyectó el omalizumab Dolor, especialmente en las articulaciones, brazos o piernas Cansancio Dolor de oído Dolor de cabeza Náuseas Hinchazón adentro de la nariz, la garganta o los senos nasales

6 Hibridomas Célula de linfocito B productor de anticuerpo de interésCélula de mieloma de ratón de tipo murino

7 Producción de hibridomas

8 Medio de cultivo de hibridomasEn el proceso de generación de los hibridomas las células hibridas productivas son seleccionadas en un medio de cultivo selectivo (HAT) Se trata del medio más conocido y empleado en investigación y en la industria.

9 El medio HAT es un medio selectivo y contiene Hipoxantina, Timidina y AminopterinaHipoxantina: base nitrogenada púrica que se obtiene por desaminación de la adenina. La timidina es un nucleósido formado cuando la timina se enlaza a un anillo de desoxirribosa. La aminopterina es un antagonista competitivo del ácido fólico, el cual es necesario en la síntesis de los nucleótidos necesarios para estructurar el DNA

10 ¿Por qué utilizar este medio selectivo?En la suspensión celular posterior a la fusión se encuentran también células de mieloma sin fusionar, fusiones de mieloma-­mieloma o linfocitos no fusionados. Los linfocitos no fusionados que mueren espontáneamente a los pocos días. Las células tumorales fusionadas entre sí y las no fusionadas se multiplican rápidamente, a una tasa igual o mayor que la de los hidridomas productivos y es necesario eliminarlas.

11 Se emplean células de mieloma carentes en la enzima hipoxantinaguaninafosforibosiltransferasa (HGPRT) La HGPRT permite la utilización de bases púricas o pirimidímicas de origen exógeno para la síntesis de DNA celular. La aminopterina al ser un antagonista competitivo del ácido dihidrofólico, bloquea el empleo de bases nitrogenadas endógenas para la síntesis de DNA.

12 Al no poseer la HGPRT que permite emplear las bases nitrogenadas de origen exógeno y debido a la aminopterina tampoco poder emplear las bases nitrogenadas endógenas, las células de mieloma no fusionadas y las fusiones mieloma- mieloma morirán. Los linfocitos B presentan la información genética para la síntesis de HGPRT y la aportan a la célula híbrida permitiendo su sobrevivencia al emplear las bases nitrogenadas del medio selectivo externo para la síntesis de DNA.

13 Extracción por precipitación de afinidadLa precipitación de afinidad es un método no cromatográfico que es útil para la purificación y replegamiento de proteínas (Gautam S. et. al. 2012). Combina la sencillez y el rendimiento fácil de los métodos de precipitación con la especificidad y la selectividad de las interacciones de afinidad. Para la recuperación y purificación de un anticuerpo monoclonal IgG1 (mAB) a partir de sobrenadante de cultivo de hibridoma se puede hacer mediante precipitación de afinidad con un ligando heterobifuncional basado en Eudragit S-100 Anticuerpo monoclonal IgG1

14 Lipasa de C. viscosum. Código PDB: 1CVL.Eudragit®S-100 Es un copolímero de ácido metacrílico y metacrilato de metilo, dependiente del pH Soluble en agua a pH 5.5, totalmente precipitado a un pH igual o inferior a 4.5. La solubilidad/insolubilidad se explica por un equilibrio de interacciones electrostáticas e hidrófobas entre cadenas laterales poliméricas, debido a cambios en las cargas de los grupos carboxílicos en la estructura polimérica. Se puede utilizar como ligando de afinidad una lipasa purificada de Chromobacterium viscosum. Lipasa de C. viscosum. Código PDB: 1CVL.

15 Esquema general para la purificación de un mAB directamente a partir de sobrenadante de cultivo de hibridoma por precipitación de afinidad con un ligando heterobifuncional basado en Eudragit-S-100. Eudragit+lipasa de C. viscosum se refiere al modificado (antígeno).

16 Purificación El proceso de purificación se logra mediante tres técnicas cromatográficas que incluyen: cromatografía en columna de proteína A inmovilizada, cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de intercambio aniónico. (European Medicine Agency, 2005).

17 El eluato resultante se concentra por procesos de ultrafiltración y diafiltraciónLa sustancia medicamentosa formulada se somete a pruebas de liberación de rutina, se almacena de -8ºC a -20 ° C hasta su posterior procesamiento que consiste en el liofilizado, mezcla con excipientes y envasado en viales de cristal para su comercialización.

18 Conclusiones Los medicamentos biotecnológicos deben alcanzar una pureza alta para tener una buena especificidad Los procesos de producción de mAb utilizan la hibridación de células para asegurar la producción del Ab de interés Los procesos de extracción y purificación son esenciales para que el producto sea óptimo para su uso en salud humana

19 Gracias por su atenciónBiotecnología de medicamentos