1 “Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412”ABP 34-36 “Aprendiendo del estudio clínico del TGN1412” Grupo A Curso 09-10
2 Caso del TGN1412 Marzo 2006 en “Parexel Clinical Pharmacology Research Unit” Ensayo de fármaco biotec TGN1412 Ac monoclonal humanizado superagonista de CD28 Tratamiento de leucemia linfocítica y artritis reumatoide Estudio fase clínica I: 6 afectados de fallo multiorgánico Clínica Parexel. Londres Respuesta inflamatoria sistémica Tormenta de citoquinas Fallo multiorgánico
3 MEDIANTE SUPERANTÍGENOSActivación de las células T MEDIANTE SUPERANTÍGENOS MEDIANTE ANTÍGENOS Requiere SÓLO 1 señal Requiere 2 señales distintas 1 unión de MHC de la APC con el TCR de la Tcell 2 coestimulación gracias a la interacción de múltiples ligandos de superficie de los T-cell i APCs (Estabilización de la unión intercelular i activación de señales secundarias) El complejo B7 representa CD80 y CD86
4 Humanización del anticuerpo 5.11.A15.11.A1 – CD 28 Humano TGN1412 – CD 28 Humano
5 Inmunoglobulinas Anticuerpo (Ig) = Fab (2 x (VL, CL, VH, CH1)) + Fc (CH2, CH3) VH y VL presentan subregiones hipervariables o CDR (complementarity determining regions), cuya estructura determina la especificidad por el Ag. De las dos regiones constantes (CH y CL), la CH es esencial para las funciones efectoras de la Ig, que dependen de la interacción con otras células del S.I. y con moléculas del complemento. Estructura básica: cadenas pesadas (heavy chains o HC) y cadenas ligeras (light chains o LC) unidas por puentes S-S intercatenarios regiones variables (VC , VH) y constantes (CH, CL) Las regiones variables (VH y VL) forman el sitio de unión a Ag La región “bisagra” (hinge) confiere flexibilidad a la molécula de Ig
6 Imnunoglobulinas Dominio IgConstan de aa y se clasifican en diferentes tipos de acuerdo a su tamaño y función Sandwich de dos láminas β antiparalelas. Estabilizado por: - Puentes de H - Interacciones hidrofóbicas - Puentes disulfuro Dominio Ig CONSTANTE: una hoja de 3 cadenas beta y otra de 4 Dominio Ig VARIABLE: una hoja de 5 cadenas beta y otra de 4 - Puentes de H entre las cadenas beta de cada hoja - Interacciones hidrofóbicas entre residuos de cadenas beta opuestas en el interior - Puentesdisulfuroentre las cadenas Explicar lo que pone en la diapo. En la parte donde pone dominios explicar también que en el dominio constante una de las hojas tiene 3 cadenas, y ésta es homóloga a la hoja del dominio variable que tiene 5 hojas beta.
7 Imnunoglobulinas Superfamilia IgLa superfamilia Ig está compuesta por proteínas que presentan uno o más dominios Ig Implicadas en el reconocimiento, unión y adhesión celular Se cree que todos los miembros de la superfamilia derivan de un ancestro común Entre los miembros de la superfamilia: Inmunoglobulinas solubles Moléculas de coestimulación Estructura básica: cadenas pesadas (heavy chains o HC) y cadenas ligeras (light chains o LC) unidas por puentes S-S intercatenarios regiones variables (VC , VH) y constantes (CH, CL) Las regiones variables (VH y VL) forman el sitio de unión a Ag La región “bisagra” (hinge) confiere flexibilidad a la molécula de Ig
8 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Otras hipótesis Tormenta citoquinas Agregación de TGN1412 Diferente CTLA-4 CD33 Homólogos remotos
9 Métodos Bases de datos Experimentales Computacionales
10 Bases de datos de proteínasSecuencia Swiss-Prot Familias Pfam PROSITE Estructura PDB CATH SCOP ENTREZ UNIPROT The protein entries in the Entrez search and retrieval system have been compiled from a variety of sources, including SwissProt, PIR, PRF, PDB, and translations from annotated coding regions in GenBank and RefSeq. PDB The mission of UniProt is to provide the scientific community with a comprehensive, high-quality and freely accessible resource of protein sequence and functional information. The RCSB PDB also provides a variety of tools and resources. Users can perform simple and advanced searches based on annotations relating to sequence, structure and function. These molecules are visualized, downloaded, and analyzed by users who range from students to specialized scientists. The PDB archive contains information about experimentally-determined structures of proteins, nucleic acids, and complex assemblies. As a member of the wwPDB, the RCSB PDB curates and annotates PDB data according to agreed upon standards. Nearly all proteins have structural similarities with other proteins and, in some of these cases, share a common evolutionary origin. The SCOP database, created by manual inspection and abetted by a battery of automated methods, aims to provide a detailed and comprehensive description of the structural and evolutionary relationships between all proteins whose structure is known. As such, it provides a broad survey of all known protein folds, detailed information about the close relatives of any particular protein, and a framework for future research and classification. SCOP CATH CATH is a manually curated classification of protein domain structures. Each protein has been chopped into structural domains and assigned into homologous superfamilies (groups of domains that are related by evolution). This classification procedure uses a combination of automated and manual techniques which include computational algorithms, empirical and statistical evidence, literature review and expert analysis. UniProtKB The UniProt Knowledgebase (UniProtKB) is the central hub for the collection of functional information on proteins, with accurate, consistent and rich annotation. In addition to capturing the core data mandatory for each UniProtKB entry (mainly, the amino acid sequence, protein name or description, taxonomic data and citation information), as much annotation information as possible is added. This includes widely accepted biological ontologies, classifications and cross-references, and clear indications of the quality of annotation in the form of evidence attribution of experimental and computational data. The UniProt Knowledgebase consists of two sections: a section containing manually-annotated records with information extracted from literature and curator-evaluated computational analysis, and a section with computationally analyzed records that await full manual annotation. For the sake of continuity and name recognition, the two sections are referred to as "UniProtKB/Swiss-Prot" (reviewed, manually annotated) and "UniProtKB/TrEMBL" (unreviewed, automatically annotated), respectively. UniParc UniParc is a comprehensive and non-redundant database that contains most of the publicly available protein sequences in the world. Proteins may exist in different source databases and in multiple copies in the same database. UniParc avoided such redundancy by storing each unique sequence only once and giving it a stable and unique identifier (UPI) making it possible to identify the same protein from different source databases. A UPI is never removed, changed or reassigned. UniParc contains only protein sequences. All other information about the protein must be retrieved from the source databases using the database cross-references. UniParc tracks sequence changes in the source databases and archives the history of all changes. UniParc has combined many databases into one at the sequence level and searching UniParc is equivalent to searching many databases simultaneously. PROSITE consists of documentation entries describing protein domains, families and functional sites as well as associated patterns and profiles to identify them [More details / References / Disclaimer / Commercial users]. PROSITE is complemented by ProRule, a collection of rules based on profiles and patterns, which increases the discriminatory power of profiles and patterns by providing additional information about functionally and/or structurally critical amino acids [More details]. PROSITE SWISS-2DPAGE contains data on proteins identified on various 2-D PAGE and SDS-PAGE reference maps. You can locate these proteins on the 2-D PAGE maps or display the region of a 2-D PAGE map where one might expect to find a protein from UniProtKB/Swiss-Prot [More details / References / Linking to SWISS-2DPAGE / Commercial users / Disclaimer]. SWISS 2D PAGE EXPASY The ExPASy (Expert Protein Analysis System) proteomics server of the Swiss Institute of Bioinformatics (SIB) is dedicated to the analysis of protein sequences and structures as well as 2-D PAGE (Disclaimer / References / Linking to ExPASy). Database of Macromolecular Movements with Associated Tools for Flexibility and Geometric Analysis CONTÉ MOLTES BASES DE DADES!!!!!!!!!!!!!! This describes the motions that occur in proteins and other macromolecules, particularly using movies. Associated with it are a variety of free software tools and servers for structural analysis. IMGT®, the international ImMunoGeneTics information system® is a high-quality integrated knowledge resource specialized in the immunoglobulins (IG), T cell receptors (TR), major histocompatibility complex (MHC), immunoglobulin superfamily (IgSF), major histocompatibility complex superfamily (MhcSF) and related proteins of the immune system (RPI) of human and other vertebrate species, created in 1989 by Marie-PauleLefranc (Université Montpellier 2, CNRS). IMGT, a European project since 1992, works in close collaboration with EBI. IMGT consists of sequence databases (IMGT/LIGM-DB, a comprehensive database of IG and TR from human and other vertebrates, with translation for fully annotated sequences, IMGT/MHC-DB, IMGT/PRIMER-DB), genome database (IMGT/GENE-DB), structure database (IMGT/3Dstructure-DB), and monoclonal antibodies database, Web resources and interactive tools. The IMGT Home page (Montpellier, France) provides a common access to all Immunogenetics data. IMGT
11 Técnicas experimentales de determinación estructuralBaja resolución (análisis cualitativo) Técnicas espectroscópicas Absorbancia UV-Vis Fluorescencia Dicroísmo circular Espectroscopía de infrarrojos Resonancia paramagnética electrónica (EPR) Resonancia magnética nuclear (RMN) de 1H (1D y 2D) – Difusión traslacional Ultracentrifugación analítica Dispersión de la luz Cromatografía de filtración en gel Resolución media Criomicroscopía electrónica RMN de estado sólido Alta resolución Cristalografía de rayos X RMN multinuclear y multidimensional
12 Dicroísmo circular ER ELDicroísmo circular Se basa en el cambio de configuración electrónica molecular de un estado fundamental a un estado excitado, debido a la absorción de radiación electromagnética polarizada circular. Ley de Lambert-Beer Absorción diferencial: ER Absorción diferencial entre las ondas EREL Fenómeno de dicroísmo circular EL Así, el campo eléctrico de una onda polarizada circular derecha (ED), se puede comparar con una hélice que gira alrededor de la dirección de la propagación. Igualmente, una componente circular izquierda (EI), constituye una hélice que gira alrededor de la dirección de propagación en la dirección opuesta a ED. Se puede considerar entonces a una onda polarizada en el plano, como la superposición de una onda polarizada circular derecha y una onda polarizada circular izquierda, ambas de la misma frecuencia. Cuando un haz de luz polarizado, incide sobre una muestra en la cual el rayo circularmente polarizado a la derecha es absorbido de una manera distinta al rayo circularmente polarizado a la izquierda, se da el fenómeno de dicroísmo circular. [el principio físico en el que se basa es la lei de lambert-beer] Los espectros de dicroismo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética: En la región del ultravioleta cercano, los cromóforos más importantes son los grupos aromáticos de las cadenas laterales de triptofano, tirosina, y fenilalanina. Ya que la asimetría en estos grupos químicos, se debe exclusivamente a su entorno y como los residuos aromáticos se encuentran distribuidos en toda la macromolécula, los espectros en esta región son un reflejo de la conformación global de la proteína. Los espectros de dicroismo en la región del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí. La asimetría de estos cromóforos se debe al arreglo espacial de la cadena principal de la proteína, por lo cual, las señales de dicroismo circular se pueden interpretar en términos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir, del porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformación estructural (hélices a, hojas b, giros y otros tipos estructurales). Un haz de luz polarizado es aquel que tiene su vibración electromagnética en un solo plano. Un haz de luz polarizado circularmente está formado por dos haces de luz de polaridad plana. - Se obtiene girando el plano de polarización de forma continua y en un solo sentido alrededor del eje de propagación de la fase luminosa.
13 Dicroísmo circular Los espectros de dicroísmo circular se obtienen generalmente en las regiones del ultravioleta cercano (250 a 350 nm) y lejano (180 a 250 nm) de la radiación electromagnética. La interacción de la radiación con la muestra induce un desfase y un cambio de magnitud diferenciales en ambos componentes circularmente polarizados de la luz(ER y EL), y estos fenómenos provocan una rotación del plano de polarización en un ángulo a y la distorsión de este plano genera una elipse en vez de una circunferencia Espectro de dicroísmo circular de estructurassecundariaspuras Onda en sentidohorario, o giro derecho (ER) Onda en sentidoantihorario, o giro izquierdo (EL) Cuando un haz de luz polarizado, incide sobre una muestra ópticamente activa en la cual el rayo circularmente polarizado a la derecha es absorbido de una manera distinta al rayo circularmente polarizado a la izquierda, se da el fenómeno de dicroísmo circular Como consecuencia de la diferencia de absorción entre EI y ED, la longitud del vector EI es distinto a la longitud del vector ED y la resultante E no describe una circunferencia, sino una elipse La absorción preferencial de un componente se mide como un valor de elipticidad(dicroísmo circular), que puede ser + o - Descomposición de luz linealmente polarizada en dos componentes de polarización circular
14 Aplicaciones y usos del DCDicroísmo circular Aplicaciones y usos del DC Determinación de la estructura secundaria de proteínas que no se pueden cristalizar o que es difícil (proteínas de membrana o de dentro de vesículas lipídicas) Cambios estructurales inducidos por el entorno (pH, Tª, solventes...) Estudio de interacciones proteína-proteína y ác.nucleico-proteína Ventajas Simple, rápido, no destructivo Requiere concentraciones menores que para RMN Podemos usar moléculas de cualquier tamaño Herramienta complemento para técnicas más detalladas (cristalografía y RMN) Sólo determina la estructura secundaria Los espectros de estructuras secundarias puras NO son comparables con espectros que solamente tienen una fracción de esa estructura No hay consenso en el límite de las bandas del espectro de UV cercano y el UV lejano
15 Espectroscopía de infrarrojoEspectrometría de absorción que utiliza la región infrarroja del espectro electromagnético Las moléculas absorben frecuencias específicas determinadas por su estructura (frecuencias resonantes) Frecuencia absorción= frecuencia a la que el enlace o grupo vibra
16 Espectroscopía de infrarrojoUn haz policromático se separa en dos en el separador 2. Uno de los haces hijo atraviesa la muestra y el otro una referencia 3. El detector registra la intensidad del haz transmitido: varia según la interferencia sea constructiva o destructiva 2 3 1
17 Espectroscopía de infrarrojoFTIR: Espectroscopía de infrarrojo con transformada de Fourier: Interferograma (intensidades vs tiempo) Espectro IR (intensidad vs frecuencia) Información estructural: estructura secundaria Transformada de Fourier
18 Espectroscopía de infrarrojoPermite el estudio de moléculas identificando sus grupos funcionales El grupo más característico y numeroso de las proteínas es el amida Modos de vibración del grupo amida: Aplicaciones: mediciones, control de calidad, mediciones dinámicas, cambios en el carácter o la cantidad de un enlace particular… Sólo determina la estructura secundaria No hay consenso en el límite de las bandas Vibración NH (amida A) - Vibración amida I (enlace C=O): Correlación frecuencia – estructura - Vibración amida II - Otros: vibraciones amida (III, IV, V, VI y VII), estiramientos (NC, CN y CC) y las deformaciones (CCN y CNC) Aqui decir que no todos los autores coinciden con los límites de las bandas
19 Microscopía electrónicaLa microscopía electrónica utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imagenes microscópicas. Funcionamiento de un microscopio electrònico: Generación del haz de electrones por un cañón electrónico [2]. Los electrones [3] viajan en el vacío, y son acelerados por un alto voltaje y focalizado por medio de lentes magnéticas. Los electrones atraviesan la muestra [7]. Un conjunto de lentes magnéticas amplifican la señal resultante y forman una imagen sobre una placa fotográfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones. Captamos la imagen con un ordenador, con el que se le puede dar color (ya que la imagen obtenida es en blanco y negro). (1) carcasa, (2) emisor de electrones, (3) electrones, (4) cátodo, (5) ánodo, (6) inductor de enfoque, (7) muestra analizada, (8) detector.
20 Microscopía electrónicaTinción negativa Criomicroscopía La proteína se congela en nitrógeno líquido Haz de electrones Haz de electrones Proteína Proteína Necesidad de software para reconstrucción tridimensional. Soporte de carbono Capa de carbón Imagen final Los electrones que inciden sobre la proteína sufren más dispersión y generan una imagen oscura Imagen final Los electrones que inciden sobre la sal del átomo pesado sufren una mayor dispersión y generan un fondo oscuro, mientras que los que atraviesan la proteína generan una imagen brillante
21 Cristalografía de Rayos XIncidencia de un haz de rayos X a través de un cristal (contiene la proteína en estudio) El haz escinde en diferentes direcciones por la simetría de los átomos y por el fenómeno de difracción Los rayos X son difractados por los electrones de las moléculas de proteína cristalizada (patrón de difracción) La posición e intensidad de cada punto está determinada por las fases de las ondas que forma cada punto (mapa de densidad electrónica) La cristalografía asistida por rayos X es el principal método de obtención de información estructural en el estudio de proteínas y otras macromoléculas orgánicas (como la doble hélice de ADN, cuya forma se identificó en patrones de difracción de rayos X). El análisis de moléculas tan complejas y, muy especialmente, con poca simetría requiere un análisis muy complejo utilizándose ordenadores para ajustar el patrón de difracción a las posibles estructuras. El Banco de Datos de Proteínas (PDB) contiene información estructural de proteínas y otras macromoléculas biológicas. La cristalografía de rayos X es una técnica consistente en hacer pasar un haz de rayos X a través de un cristal de la sustancia sujeta a estudio. El haz se escinde en varias direcciones debido a la simetría de la agrupación de átomos y, por difracción, da lugar a un patrón de intensidades que puede interpretarse según la ubicación de los átomos en el cristal, aplicando la ley de Bragg. La posición e intensidad de cada punto es determinada relativamente fácil, las fases de las ondas que formaron cada punto debe ser también determinada para producir un mapa de densidad electrónica. Resolver el "problema de la fase" es el segundo obstáculo. A menudo esto se acompaña al irradiar dos o más derivados del mismo cristal que difieren solamente en la presencia de iones de metales pesados. Este es el método del "remplazo isomórfico" y requiere que los iones de metal sean incorporados en un cristal sin afectar la estructura, lo cual en ocasiones no es posible. Una solución más reciente para resolver el problema de la fase involucra utilizar la radiación de zincrotrón a varias longitudes de onda y ha acelerado la velocidad para resolver estructuras cristalinas. La descripción completa de cada reflexión - su posición, intensidad y fase - es denominada "factor de estructura". Los factores de estructura están disponibles en el PDB para aproximadamente 25 % de las entidades cristalográficas. Al publicar los factores de estructura, permite a otros investigadores generar y examinar los mapas de densidad o tratar refinamientos alternativos o métodos de fase. Construcción de modelo de proteína
22 Análisis computacionalRMN Basado en propiedades mecánico-cuánticas de protones o neutrones: Spin Aplicación de un campo magnético alterno perturbación del spin Desaparición del campo posición inicial de spins Cambio de estados liberación energética captada por receptor La resonancia magnética nuclear (RMN) es un fenómeno físico basado en las propiedades mecánico-cuánticas de los núcleos atómicos. RMN también se refiere a la familia de métodos científicos que explotan este fenómeno para estudiar moléculas (espectroscopia de RMN), macromoléculas (RMN biomolecular), así como tejidos y organismos completos (imagen por resonancia magnética). Todos los núcleos que poseen un número impar de protones o neutrones tienen un momento magnético y un momento angular intrínseco, en otras palabras, tienen un espín > 0. Las frecuencias a las cuales resuena un átomo (i. e. dentro de una molécula) son directamente proporcionales a la fuerza del campo magnético ejercido, de acuerdo con la ecuación de la frecuencia de precesión de Larmor. La RMN estudia los núcleos atómicos al alinearlos a un campo magnético constante para posteriormente perturbar este alineamiento con el uso de un campo magnético alterno, de orientación ortogonal. La resultante de esta perturbación es el fenómeno que explotan las distintas técnicas de RMN. Análisis computacional Imagen
23 Cristalografía Rayos X vs RMNCRISTALOGRAFÍA DE RAYOS X RMN Ventajas Alta resolución a nivel atómico ( estructura de la proteína a partir de la densidad electrónica ) La proteína se estudia suspendida en su medio natural Sin límite de tamaño molecular Permite obtener información dinámica: unión de ligandos y cambios de estructura Inconvenientes Se necesita un monocristal (la cristalización puede generar distorsiones ) Limitación de tamaño (límite de 40kDa) La proteína se encuentra fuera de su medio natural Estructura poco definida
24 Métodos
25 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Tormenta citoquinas
26 Objetivo: Comparar la cantidad de CD28 en humanos y en macacos.Hipótesis 1: Diferente concentración de CD28humano/macaco Objetivo: Comparar la cantidad de CD28 en humanos y en macacos. Numerosos estudios desmienten una concentración diferencial del receptor similar o igual Com es veu la imatge i com hem dit abans, el recetor CD28 es troba a la membrana dels limfocits T i son els mediador de la resposta activadors després de que la cèl·lula APC hagi presentat el seu antigen a la Tcell. Schraven B, Kalinke U. CD28 Superagonists: What Makes the Difference in Humans? Cell Press Immunity 2008.
27 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Tormenta citoquinas
28 Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macacoObjetivo Saber si TGN1412 se une a una región distinta del CD28 o con distinta afinidad en las dos especies. Métodos 1. Comparación secuencias CD28 humano/CD28 macaco: clustalW Department of Medicine, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina 27710, USA. The calm after the cytokine storm: lessons from the TGN1412 trial. J ClinInvest Jun;118(6):2365.
29 Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco2. Localización y visualización en el modelo de las mutaciones en el receptor (VMD): - lugar de interacción? 3. Análisis de las energías de interacción: EBI-PISA No Descartar hipótesis Sí Modelaje CD28macaco - TGN1412 Comparación con CD28humano-TGN1412
30 Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macacoPROBLEMA!!! Secuencias distintas de CD28 de macaco en SwissProt y en el artículo estudiado
31 Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco
32 Mutaciones en la región transmembrana.Hipótesis 2: Diferencia entre CD28 humano/CD28 macaco Mutaciones en la región transmembrana. CD28 de macaco alineado con la parte de CD28 humano que interacciona con TGN1412, la utilizada para crear los modelos. Los residuos que difieren en el CD28 de macaco respecto al humano, no son del lugar de interacción con el TGN1412
33 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Tormenta citoquinas Diferente CTLA4
34 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Búsqueda de proteínas homólogas de CD28 con PSI-BLAST. TGN1412 se podría unir a CTLA-4 Miramos unión del TGN1412 a CTLA-4 de las diferentes especies
35 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4¿Por qué es interesante mirar la unión a CTLA4? Es un inhibidor de la activación de las células T Diferencias en la unión TGN1412-CTLA-4 en diferentes especies podría dar diferente nivel de inhibición
36 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Objetivos Averiguar si el TGN1412 se puede unir al CTLA-4 Métodos Generación del modelo TGN1412-CTLA4 a partir del modelo de TGN1412-CD28 Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en humano con la unión TGN1412-CD28 en humano Comparación de la unión TGN1412-CTLA4 en macaco con la unión TGN1412-CTLA4 en humano
37 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano CTLA-4 humano ClustalW CD28humano – CTLA-4humano
38 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412 Models interacciócd28huma ambctla4 humàimacac, acompanyatsdelsprosacorresponent,s per a comprobar la fiabilitat del model Prosahumà (esquerra) 1-vermell motlle: cd28 2- groc model: ctla4 humà Prosamacac (dreta) 1-vermell motlle: ctla4 humà 2- groc model: ctla4 macac CD28h A1 (molde) CD28h + TGN1412 (molde) CD28h + TGN1412 CTLA4h + TGN1412
39 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano Átomo cadena Ligera Distancia (A) CD28 1 TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494 [O] 2 GLN 92 [NE2] 3.53 ASP 495 [O] Átomo cadena Pesada Átomo CD28 THR 244 [OG1] 3.82 MET 531 [O] SER 245 [OG ] 3.46 GLU 464 [OE2] 3 TYR 315 [OH] 2.57 GLU 529 [OE1] 4 3.86 TYR 536 [OH] 5 ASP 318 [N] 3.64 TYR 493 [OH] 6 TYR 315 [O] 3.27 ARG 466 [NE] 7 GLY 316 [O] 3.63 8 2.62 9 ASP 318 [O] 3.17 LYS 495 [NZ] CD28 humano – TGN1412 Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CD28 1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1] 2 3.14 GLU 463 [OE2] 3 HIS 314[ NE2] 3.71 4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2] 5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O] 6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE] 7 TYR 315 [O] 2.85 cadena Ligera TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O] CTLA-4 humano – TGN1412
40 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano Residuo cadena Pesada 1 GLY 268 2 GLY 316 3 LEU 317 4 TRP 319 ResiduoCD28 VAL 481 PRO 533 PRO 534 GLY 497 Residuo Cadena ligera TRP 32 GLY 91 I. hidrofóbicas CD28 humano – TGN1412 E.iónicos Átomo cadena pesada Distancia (A) CTLA4h 1 B:HIS 314[ NE2] 3.71 C:GLU 463[ OE2] Residuo cadena Pesada THR 242 2 THR 244 3 GLY 268 4 GLY 316 5 LEU 317 6 TRP 319 Átomo CTLA4h MET 485 LEU 493 MET 529 PRO 532 5 ILE 497 Átomo cadena ligera TRP 32 GLY 91 I. hidrofóbicas CTLA-4 humano – TGN1412
41 Área de interacción (A2) Área de interacción (A2)Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CD28 humano CD28 humano – TGN1412 CTLA-4 humano – TGN1412 cadena pesada INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada CD28 humano 449.3 -4.0 CadenaLigera CD28 humano 180.1 -0.8 INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada CTLA-4 macaco 434,9 -5,5 CadenaLigera 172,3 -1,3 CD28 humà amb tgn1412: Cadena vermella: B (heavy) Cadena blava: C (light) Cadena gris: cd28 Estan representats els ponts d’hidrogen de la taula amb els corresponents residus cadena ligera
42 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano CTLA-4 macaco ClustalW CTLA-4 humano – CTLA-4 macaco
43 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412 Models interacció tgn1412 amb ctla4 humà i macac, acompanyats dels prosa corresponent,s per a comprobar la fiabilitat del model Prosa humà (esquerra) 1-vermell motlle: cd28 2- groc model: ctla4 humà Prosa macac (dreta) 1-vermell motlle: ctla4 humà 2- groc model: ctla4 macac CD28h + TGN1412 (molde) CTLA4h + TGN1412 (molde) CTLA4h + TGN1412 CTLA4m + TGN1412
44 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412 Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CTLA-4 1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1] 2 3.14 GLU 463 [OE2] 3 HIS 314[ NE2] 3.71 4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2] 5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O] 6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE] 7 TYR 315 [O] 2.85 cadena Ligera TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O] Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CTLA-4 1 SER 245 [OG] 2.94 C:GLU 463[ OE1] 2 HIS 314 [NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2] 3 TYR 315 [OH] 3.03 C:GLU 527[ OE2] 4 THR 244[ OG1] 3.86 C:MET 529[ O ] 5 GLY 316[ O ] 3.36 C:ARG 465[ NH1] 6 TYR 247[ OH ] 3.62 C:ARG 465[ NH2] ligera TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494[O] 2 GLN 92 [ NE2 3.53 ASP 495[ O]
45 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 humano – TGN1412 CTLA-4 macaco – TGN1412 Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CTLA-4 1 SER 245[ OG ] 3.13 GLU 463 [OE1] 2 3.14 GLU 463 [OE2] 3 HIS 314[ NE2] 3.71 4 TYR 315[ OH ] 2.60 GLU 527 [OE2] 5 THR 244 [OG1] 3.78 MET 529 [O] 6 GLY 316 [O] 2.73 ARG 465 [NE] 7 TYR 315 [O] 2.85 cadena Ligera TRP 32 [NE1] 3.18 ASP 494 [O] Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo CTLA-4 1 SER 245 [OG] 2.94 C:GLU 463[ OE1] 2 HIS 314 [NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2] 3 TYR 315 [OH] 3.03 C:GLU 527[ OE2] 4 THR 244[ OG1] 3.86 C:MET 529[ O ] 5 GLY 316[ O ] 3.36 C:ARG 465[ NH1] 6 TYR 247[ OH ] 3.62 C:ARG 465[ NH2] ligera TRP 32 [NE1] 3.12 ASP 494[O] 2 GLN 92 [ NE2 3.53 ASP 495[ O]
46 Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA-4 Humano – TGN1412 CTLA- 4- Macaco – TGN1412 E.iónicos Átomo cadena pesada Distancia(A) ÁtomoCTLA4h 1 HIS 314[ NE2] 3.71 GLU 463[ OE2] E.iónicos Átomo cadena esada Distancia(A) ÁtomoCTLA4m 1 B:HIS 314[ NE2] 3.56 C:GLU 463[ OE2] Interacciones hidrofóbicas Interacciones hidrofóbicas Átomo cadena pesada 1 THR 242 2 THR 244 3 GLY 268 4 GLY 316 5 LEU 317 6 TRP 319 Átomo CTLA4h 1 MET 485 2 LEU 493 3 MET 529 4 PRO 532 5 ILE 497 Átomo CTLA4m 1 ALA 481 2 MET 485 3 LEU 493 4 ILE 497 5 MET 529 6 PRO 532 Átomo cadena Pesada 1 GLY 268 2 GLY 316 3 TRP 319 Átomo cadena ligera 1 TRP 32 2 GLY 91 Átomo cadena ligera 1 TRP 32 2 GLY 91
47 Área de interacción (A2) Área de interacción (A2)Hipótesis 3: Unión de TGN1412 a CTLA-4 Comparación de CTLA-4 humano con CTLA-4 macaco CTLA4humano – TGN1412 CTLA4 macaco – TGN1412 cadena pesada INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada CTLA-4 humano 433,4 -6,4 CadenaLigera 170,6 -1,6 INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada CTLA-4 macaco 434,9 -5,5 CadenaLigera 172,3 -1,3 Energies en la interacció cadenes del tgn1412 i ctla4 humà i macac En vermell estan marcats els residus de la interfase Interfase superior cadena lleugera amb receptor Interfase inferior cadena pesada amb receptor cadena ligera
48 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Tormenta citoquinas Diferente CTLA-4 Homólogos remotos
49 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? Mediante ModLink: búsqueda de homólogos remotos de TGN1412 Prot X TGN1412 Diana Y Diana Y TGN1412 Modlink es un programa que nos permite encontrar aquellasproteinas que comparten una regionaminoacidica y estan formandoparte de una mismafamilia proteica (clasificadas en el SCOP). Es decir nos pemite encontrar homologias de estructura. Ademas nos muestratodasaquellasmoleculas con las que esta interaccionando la proteina homologa con nuestraproteina problema. A partir de estos resultados, se podria deducir , que nuestraproteina problema tambien esta interaccionando con la mismamolecula. (De la diapo con los resultados de Modlink , que hemos quitado) Este es el output del modlink , en el cual los primeroscodigoscorresponden a aquellasproteinas que presentan alguna homologia con nuestraproteina problema (porque hemos ingresado como query la secuencia de TGN1412). A demas estos resultados nos permiten encontrar aquellasproteinas con las que esta interaccionando. Hemos elegidoaquellasproteinashomologas (anticuerpos) que esteninteraccionando con una proteina que este implicada de alguna manera, en el desarrollo de una tormenta de citoquinas. De los resultados , hemos escogido 3 proteinashomologas: Dos de ellas son proteinas que participan en la via intrinseca de coagulacion. Y la otra esta relacionada con las interleuquinas Interleuquinas Interleuquinas
50 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? 10C12 - Factor de coagulación IX humano BO2C11 – Factor VIII de Coagulación humano
51 ?? Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? 10C12 Interactúa TGN1412 podría interactuar En la respuesta sistemica estan implicados mediadores celulares y proteicos. La expresion de estos, es diferente en relacion al nivel de activacion de cada via individual. En paralelotambien se encuentran los sistemasplasmaticos. Estos ultimos, son un grupo de proteinas que se activan de forma secuencial. Llevando a un efecto final en una o mas targets. Esta conformado por cuatrocascadasplasmaticas : cascada de las kininas, de coagulacion, fibrinolisis y los sistemas de complemento. EL sistema de coagulacion esta directamenterealacionado con la respuestainflamatoria . Esto se lleva a cabo por componentesespecificos : trombina y factor X. Hemos encontrado el Ab 10C12 que es homologa al TGN1412, y que esta interactuando con el factor IX de la coagulación. Este Ac se esta investigando par el tratamiento de enfermedadesvasculares como la trombosis. En principio , cuando el factor IX se activa en la via intrinseca, se forma Ixa activa , que permite la activacionsecuencial de otrasproteinas. La activación de esta via , lleva a la activación de la trombina , la cualademasinduce la formación de IL-2 i IL-6 (implicadas en la tormenta de citokinas , en fallosmutiorganicos como el caso de TGN1412). Nuestrahipotisis inicial: El TGN1412 podria interaccionar tambien con el factor IX , pero no necesariamenteimpidiendo la activación de la via intrinseca de la coagulacion (como hace el 10C12) sino, que podria hacer lo contrario, es decirpermitir la actividad del factor IX i favorecer la activacion de la via incrementa Trombina altos niveles de IL-2 IL6 . IL-2 IL-6 (Cytokine storm) factor IX ?? El TGN1412 podría activar la vía intrínseca de coagulación y activar la trombina HIPÓTESIS
52 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? 10C12 con Factor de coagulación IX humano TGN1412 con Factor de coagulación IX humano 10C12 + factor IX (molde) TGN factor IX
53 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación IX humano CDR1 CDR2 CDR3
54 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor IX de coagulación? Ligera Pesada CDR1 CDR1 10C12 S G T N I Y V TGN14 H A Q - W L 10C12 T Y A M H TGN14 S I Hicimos un alineamiento entre las cadenas pesadas de los anticuerpos :10C12 (nuestra proteina con interacción homologa) y TGN1412 Observamos que existen algunas regiones que comparten ambas secuencias. En el caso de lod CDR : observamos que existen diferencias entre los aminoacidos, por lo tanto los CDR son diferentes. En el CDR1 : se conerva solo un aminoacido, en el CDR2 : se conserva un solo aa , y en el CDR3: no se conserva ningun aa En aquellas regiones que no se han conservado: Algunos aa de la primera secuencia , han sido cambiados a otro tipo de aa pero con las mismas propiedades quimicas (Ex: de hidrfoboc hidrofobic ..) como tambien de aquellos cambios , donde son aa con propiedades quimicas totalmente diferentes. Leyenda : Lila = polar –> polar Amarillo = conservados Azulclaro = hidrofobico hidrofobico Naranja = cargado cargado Blanco = aparición de GAPS Rojo = cambios de Hidrofobico polar , polar hidrofobico , cargado hidrofobico (las propiedadesquimicas no se mantienen) Ademas de los CDRs no conservados, que descarta nuestrahipotesis inicial. El factor IX, tiene una estructura helix – alfa, lo que no favorece una interacción con una proteina beta sandwich ( estructura secundaria del TGn1412). CDR2 CDR2 10C12 I S Y D G K A V TGN14 C P N T E F 10C12 D V S K R P TGN14 A N L H T CDR3 CDR3 10C12 A W D S L E F TGN1412 Q G - T Y P 10C12 A S I R V L D Y TGN14 H G W N F
55 ?? Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? BO2C11 Interactúa TGN1412 podría interactuar En la respuestasistemica estan implicados mediadores celulares y proteicos. La expresion de estos, es diferente en relacion al nivel de activacion de cada via individual. En paralelotambien se encuentran los sistemasplasmaticos. Estos ultimos, son un grupo de proteinas que se activan de forma secuencial. Llevando a un efecto final en una o mas targets. Esta conformado por cuatrocascadasplasmaticas : cascada de las kininas, de coagulacion, fibrinolisis y los sistemas de complemento. EL sistema de coagulacion esta directamenterealacionado con la respuestainflamatoria . Esto se lleva a cabo por componentesespecificos : trombina y factor X. Hemos encontrado el Ab BO2C11 que es homologo remoto del TGN1412, y que esta interactuando con el factor VIII de la coagulación. Este Ac se estáusando para investigar la unión al factor VIII . En principio , cuando el factor IX se activa en la via intrinseca, se forma Ixa activa , que permite la activacionsecuencial de otrasproteinas. La activación de esta via , lleva a la activación de la trombina , la cualademasinduce la formación de IL-2 i IL-6 (implicadas en la tormenta de citokinas , en fallosmutiorganicos como el caso de TGN1412). Nuestrahipotisis inicial: El TGN1412 podria interaccionar tambien con el factor IX , pero no necesariamenteimpidiendo la activación de la via intrinseca de la coagulacion (como hace el 10C12) sino, que podria hacer lo contrario, es decirpermitir la actividad del factor IX i favorecer la activacion de la via incrementa Trombina altos niveles de IL-2 IL6 . IL-2 IL-6 (Cytokine storm) factor VIII ?? El TGN1412 podría activar la vía extrínseca de coagulación y activar la trombina HIPÓTESIS
56 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? TGN1412 -Factor de coagulación VIII humano BO2C11 – Factor de coagulación VIII humano BO2C11 + factor VIIIh (molde) TGN factor VIIIh
57 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación? CDR del modelo TGN1412 con Factor de coagulación VIII humano CDR1 CDR2 CDR3
58 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? Cadena Pesada: Cadena Ligera: CDR1 CDR1 BO2C11 G Y T L E P V TGN1412 F S I Hemos visto que los CDR más o menos se conservan. Hemos seguido con esta hipótesisdebido a que hemos visto que el anticuerpohomólogoremoto BO2C11 se uneal factor VIII por un epítopoconformacional en el dominio C2, y no por pura secuencia. BO2C11 R A S Q F Y L TGN1412 H N I - V W CDR2 CDR2 BO2C11 G S F D P E I Y A R Q TGN1412 C N V T K BO2C11 Y G A S T R TGN1412 K N L CDR3 CDR3 BO2C11 C A V P D - F I TGN1412 T R S H Y G L W N BO2C11 C Q K Y G T S A TGN1412 P
59 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? “Epitope mapping using fragments of the factor VIII C2 domain indicated that BO2C11 does not recognize a linear epitope corresponding to a single stretch of amino acid residues.30 Rather, it interacts with a conformational epitope composed of side chains from various regions within the C2 sequence that are adjacent to each other in the folded protein”. Epitope mapping using fragments of the factor VIII C2 domain indicated that BO2C11 does not recognize a linear epitope corresponding to a single stretch of amino acid residues.30 Rather, it interacts with a conformational epitope composed of side chains from various regions within the C2 sequence that are adjacent to each other in the folded protein
60 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? Enlaces Hidrógeno Átomo cadena Ligera Distancia (A) Átomo Factor VIII THR 93[ OG1] 3.74 THR 456[ OG1] TRP 32[ NE1] 3.78 THR 456[ O ] 3.39 ASN 457[ O ] Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo Factor VIII TRP 319[ N ] 2.75 ASN 457[ OD1] THR 244[ O ] 3.41 ARG 474[ NH2] GLY 316[ O ] 2.65 ARG 479[ NH2] ASP 318[ OD1] 3.26 ARG 479[ NH2] TYR 315[ OH ] 3.49 GLN 575[ N ] TYR 315[ OH ] 2.70 GLN 575[ NE2]
61 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación HUMANO? Hidrofóbicos Átomo cadena Pesada 1 B:VAL 216 2 B:GLY 240 3 B:ILE 265 4 B:GLY 316 5 B:LEU 317 6 B:VAL 323 Átomo cadena Ligera 1 A:VAL 31 2 A:LEU 54 3 A:GLY 91 4 A:PRO 95 Átomo Factor VIII 1 C:PHE 455 2 C:MET 458 3 C:PHE 459 4 C:ALA 460 5 C:GLY 473 6 C:VAL 482 7 C:LEU 510 8 C:LEU 511 9 C:MET 514 IÓNICOS Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo Factor VIII B:ASP 318[ OD1] 3.26 C:ARG 479[ NH2]
62 Área de interacción (A2) Área de interacción (A2)Hipótesis 4: Homólogos remotos ¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación? CD28 humano – TGN1412 Factor VIII humano – TGN1412 Cadena Pesada INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada CD28 humano 449.3 -4.0 Cadena Ligera CD28 humano 180.1 -0.8 INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada Factor VIII humano 786.5 -10.3 Cadena Ligera 462.4 -2.7 Cadena Ligera
63 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN? TGN Factor coagulación VIII humano TGN Factor coagulación VIII ratón Ahoramiramos las energías en ratón para ver si haydiferencias entre uno y otro y ver si éstasfueron las causantes de la tormenta de citoquinas. TGN1412+ factor VIII humano (molde) TGN factor VIII ratón
64 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN? Enlaces Hidrógeno Átomo cadena Pesada Distancia (A) Átomo Factor VIII ratón 1 HIS 314[ ND1] 3.82 THR 512[ OG1] 2 TYR 247[ OH ] 3.58 ASN 457[ ND2] 3 TYR 266[ OH ] 2.98 ARG 474[ NE ] 4 SER 245[ O ] 3.02 ARG 474[ NH2] 5 GLY 316[ O ] 2.79 ARG 479[ NH1] 6 ASP 318[ OD1] 3.79 ARG 479[ NH2] 7 TYR 246[ OH ] 3.80 LEU 510[ N ] 8 TYR 315[ OH ] 3.47 GLN 575[ N ] 9 2.70 GLN 575[ NE2] Átomo cadena ligera Distancia (A) Átomo Factor VIII ratón 1 LYS 50[ NZ ] 3.58 GLN 481[ O ]
65 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN? Átomo cadena pesada Distancia (A) Factor VIII 1 B:ASP 318[ OD1] 3.79 C:ARG 479[ NH2] Átomo cadena ligera 1 TRP 32 2 LEU 54 3 GLY 91 4 PRO 95 Átomo Factor VIII 1 MET 485 2 TRP 572 3 PHE 455 4 MET 458 5 PHE 459 6 TRP 462 7 GLY 473 8 LEU 510 9 PHE 511 10 MET 514 Átomo cadena Pesada 1 TRP 261 2 ILE 265 3 GLY 316 4 LEU 317 5 TRP 319
66 Hipótesis 4: Homólogos remotos¿Se puede unir TGN1412 al factor VIII de coagulación de RATÓN? Factor VIII ratón – TGN1412 Factor VIII humano – TGN1412 Cadena Pesada INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada Factor VIII ratón 763.1 -11.3 CadenaLigera 444.8 -3.2 INTERACCIÓN Área de interacción (A2) Energía (Kcal/mol) Cadena pesada Factor VIII humano 786.5 -10.3 CadenaLigera 462.4 -2.7 Cadena Ligera
67 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Tormenta citoquinas Diferente CTLA-4 CD33 Homólogos remotos
68 Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33CD33: lectina tipo inmunoglobulina receptora de ácido siálico (Siglec) Inhibe activación celular mediante vías ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif) Células T macaco: alta cantidad de moléculas CD33 Células T humanas: CD33 casi indetectable ITIM Que las células T humanassufrieran una mayoractivación y por ello se desencadenara una tormenta de citoquinas, puededeberse a una mayoractivación de estas por el anticuerpo, perotambién a una menor inhibición. Las células T presentan en susuperficieotrotipo de receptores, los CD33, que son de la familia de las inmunoglobulinas. Es un receptor de ácidosiálico que transmite una señalinhibitoria, y downregulan la activacióncelularmediantevías ITIM (Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif). CD33 es una familia de receptores de las células del sistema inmune. Averiguar si el TGN1412 se une a estos receptores que tienenplegamiento beta (como el CD28), podría resultar muyinteresantepuesto que los humanospresentanmuybajaconcentración de cd33, y en cambio las células T de macaco lo expresan en alta cantidad. Si de verdad se uniera el TGN1412 al cd33, podría ser que inhibiera la activación de las células T en macaco pero no en humanos.
69 Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33Objetivo Estudiar la posibilidad que TGN1412 se una a CD33 y se de una inhibición diferente en humano y macaco. Métodos Estudio del docking de TGN1412 con CD33 con PyDock Análisis de la zona de interacción Análisis energético del docking Estudio del docking de TGN1412 con CD28 con PyDock Comparación de ambas posibles uniones El que ens plantegem a la hipòtesi 3 és que potser la resposta immune podria haver estat deguda a que el fàrmac (TGN1412) podira haver reaccionat amb ell mateix, formant agregats que precipiten. El que vam fer per a estudiar aquesta hipòtesis va ser analitzar les possibles interaccions entre les diferents cadenes del TGN1412 amb el pyDock. Vam analitzar tres posibles interaccions: de la cadena lleugera amb ella mateixa, un altre de la cadena pesada amb ella mateixa i un altre de la cadena pesada amb la lleugera. De cadascun dels pyDocks vam obtenir una taula amb l’energia total de la interacció.
70 Hipótesis 5: Unión TGN1412 a CD33Energía TGN1412 – CD28 Energía TGN1412 – CD33 Conf Ele Desol VDW Total Rank 375 -3.191 74.247 1 436 -3.681 14.179 2 389 3 48 -6.228 4 307 -5.347 5 Conf Ele Desol VDW Total Rank 371 -6.107 48.160 1 123 2 386 -3.065 -9.583 3 96 2.408 -9.150 4 410 -3.009 58.017 -8.133 5
71 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Tormenta citoquinas Agregación de TGN1412 Diferente CTLA-4 CD33 Homólogos remotos
72 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Objetivo Estudiar la posibilidad que TGN1412 forme agregados con él mismo y precipite Métodos Estudio del docking de las diferentes cadenas del TGN1412 con PyDock: Cadenas ligera-ligera Cadenas pesada-pesada Cadenas pesada-ligera El que ens plantegem a la hipòtesi 3 és que potser la resposta immune podria haver estat deguda a que el fàrmac (TGN1412) podira haver reaccionat amb ell mateix, formant agregats que precipiten. El que vam fer per a estudiar aquesta hipòtesis va ser analitzar les possibles interaccions entre les diferents cadenes del TGN1412 amb el pyDock. Vam analitzar tres posibles interaccions: de la cadena lleugera amb ella mateixa, un altre de la cadena pesada amb ella mateixa i un altre de la cadena pesada amb la lleugera. De cadascun dels pyDocks vam obtenir una taula amb l’energia total de la interacció.
73 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412Respuesta Inmunitaria: Papel de celulas T , citoquinas, macrogafo, interleuquinas AGREGACIÓN Activación de la respuesta Inmunitaria: células T, neutrófilos, macrógafos IFN-γ IL-6 IL-12 IL- 1 IL-18
74 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412 Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank 51 6.275 1 389 2 44 -9.586 76.122 3 17 9.155 60.731 4 96 5 Ligera-ligera Conf Ele96 Desolv VdW TOTAL Rank 157 -6.127 1 277 -4.600 47.053 2 129 -8.570 3 28 4 49 5 Pesada-pesada Vam veure que l’energia d’interacció lleugera amb lleugera (-27) era menys negativa que la d’interacció pesada-lleugera (-57) i pesada-pesada (-42). Per tant, veiem que els agregats que és més favorable que es formin són entre les cadenes pesada-lleugera. Com que aquestes dues cadenes també interaccionen de forma normal en una Fab d’una Ig normal/fisiològica, també vam analitzar les energies d’interacció d’una Fab normal, (una Fab ja cristal·litzada, disponible a la base de dades PDB) Mitjançant el mateix programa pydock també hem generat tres PDBs per veure les diferents interaccions. Conf Ele Desolv VdW TOTAL RANK 5 -4.220 1 170 2 149 -9.269 3 -7.15 4 20 -8.751 83.969 Ligera-pesada
75 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412 STAMP de ligera - pesada/Fab cristalizada Fins ara hem vist que la interacció pesada-lleugera és energèticament favorable. Ara ens cal veure si aquesta interacció és pel mateix lloc per on interaccionen les Fab normals, ja que si fos així, el pydock ens estaria predint una interacció que es dóna de forma fisicològia en una Fab, i no una interacció entre dues Fab diferents (agregació). Això ho hem analitzat fen un stamp de les dues estructures. Hem pogut descartar que no es tracta d’una interacció fisiològica ja que, com veiem, les cadenes pesada i lleugera interaccionen entre sí per llocs diferents. A més, hem analitzat els residus que participen en les dues interaccions, i veiem que són residus diferents, i que els que participen en la interacció pesada-lleugera que nosaltres hem predit poden fer .
76 Hipótesis 3: Agregación de IgGs Superfície de interacción del TGN1412Residuos HC Gln 253 Leu 259 Phe 309 Asn 320 Phe 321 Trp 324 Gly 325 Val 384 Thr 386 Residuos LC Gln 38 Pro 44 Tyr 87 Thr 97 Phe 98 Gly 99 Residuos HC Leu 34 Gln 39 Gly 42 Ser 163 Residuos LC His 168 Phe 170 Cad ligera – azul Cad. Pesada – rojo A més, hem analitzat els residus que participen en les dues interaccions, i veiem que són residus diferents, i que els que participen en la interacció pesada-lleugera que nosaltres hem predit poden fer interaccions hidrofòbiques, que són les que es donen entre dues Ig quan formen agregats entre elles . 76
77 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412 Agregación ligera-ligera /pesada-pesada/Ligera-pesada/Fab cristalizada Ligera-ligera Pesada-pesada Ligera-pesada Ligera-pesada Fab orig. TOTAL TOTAL TOTAL TOTAL Per tant, veiem que els agregats que és més favorable que es formin són entre les cadenes pesada-lleugera. Com que aquestes dues cadenes també interaccionen de forma normal en una Fab d’una Ig normal/fisiològica, també vam analitzar les energies d’interacció d’una Fab normal, (una Fab ja cristal·litzada, disponible a la base de dades PDB) En comparar-les veiem que la seva energia d’interacció és de -43, és a dir, molt semblant a la que hem obtingut en la nostra predicció de docking entre pesada i pesada (que és de -42). Inclús, comparant les energies de tots els dockings estudiats, veiem que una interacció predita entre pesada-lleugera és encara més favorable energèticament (-57). De totes maneres, la energia d’interacció lleugera-lleugra, tot i ser menys negativa, és també favorable (xk és negativa) Fins ara hem vist que la interacció pesada-lleugera és energèticament favorable. Ara ens cal veure si aquesta interacció és pel mateix lloc per on interaccionen les Fab normals, ja que si fos així, el pydock ens estaria predint una interacció que es dóna de forma fisicològia en una Fab, i no una interacció entre dues Fab diferents (agregació).
78 Hipótesis 3: Agregación de IgGs¿Como podemos justificarla tormenta de citoquinas en humanos a partir de la precipitación de TGN1412? En comparar-les veiem que la seva energia d’interacció és de -43, és a dir, molt semblant a la que hem obtingut en la nostra predicció de docking entre pesada i pesada (que és de -42). Inclús, comparant les energies de tots els dockings estudiats, veiem que una interacció predita entre pesada-lleugera és encara més favorable energèticament (-57). De totes maneres, la energia d’interacció lleugera-lleugra, tot i ser menys negativa, és també favorable (xk és negativa) Fins ara hem vist que la interacció pesada-lleugera és energèticament favorable. Ara ens cal veure si aquesta interacció és pel mateix lloc per on interaccionen les Fab normals, ja que si fos així, el pydock ens estaria predint una interacció que es dóna de forma fisicològia en una Fab, i no una interacció entre dues Fab diferents (agregació). 78
79 Hipótesis 6: Agregación de TGN1412 Comparación de energías de agregación respecto a la interacción con CD33 Ligera-ligera CD33 TOTAL TGN1412 Pesada-pesada TOTAL Una de les possibles explicacions és la diferent quantitat de CD33 present en macacs i humans. Com hem vist, en macacs trobem abundant CD33, mentre que en humans és quasi indetectable. Per tant la nostra hipòtesi seria que en humans el TGN1412, després d’unir-se a CD28, en quedés una gran part de molècules lliures, que tendirien a formar agregats precipitar resposta immune. En macacs, en canvi, el TGN1412 s’uniria al seu lligand CD28, i el TGN1412 que quedés lliure podria unir-se a CD33 (que com veiem la energia també és favorable), quedant així menys proporció de TGN1412 lliure i per tant menys TGN1412 disponible de formar agregats. TOTAL -9.583 -9.150 -8.133 Ligera-pesada TOTAL
80 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Otras hipótesis Tormenta citoquinas Agregación de TGN1412 Diferente CTLA-4 CD33 Homólogos remotos
81 Otras hipótesis Homólogos remotos 1FYH (IFNγ-Rc complex)Literatura: El Rc del IFNγ tiene ↑% láminas β (como el CD28). Enfermos de SARS que sufrieron tormenta de citoquinas tenían ↑[IFNγ ] Hipótesis: el TGN1412 se une al Rc de IFNγ y simula la tormenta de citoquinas Activación del complemento por la Fc del TGN1412 Visilizumab fármaco inmunosupresor con la región constante mutada para evitar unión a FcR. Tratamiento de Colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn.
82 Diferente nivel de expresión CD28HIPÓTESIS Diferente nivel de expresión CD28 Diferente CD28 Otras hipótesis Tormenta citoquinas Agregación de TGN1412 Diferente CTLA-4 CD33 Homólogos remotos
83 Programas y comandas utilizadosBÚSQUEDA DE PROTEÍNAS HOMÓLOGAS: PSI - BLAST 1. Búsqueda de proteínas homólogas 1.1. source /cursos/BE/programari/bashrc_aules 1.2. Búsqueda en Swissprot con Psiblast proteínas homólogas (para generar PSSM): * blastpgp -i target.fa-d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas -j 10 –C target_pssm.sport -o target_sprot10.out 1.3. Aplicar la matriz de pesos obtenida para buscar en PDB: * blastpgp -i target.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/pdb_seq -j 1 -R target_pssm.sprot-o target_pdb1.out 2. Escoger homólogos (en función E-value y resolución) 3. Generar multifasta de homólogos incluyendo nuestra proteína * FetchFasta.pl -i homologos.dat -o homologos.fa -d /cursos/BE/databases/blastdat/sprot.fas * cat target.fa>>homologos.fa ALINEAMIENTOS POR SECUENCIA: CLUSTALW * clustalw homologos.fa ALINEAMIENTOS POR ESTRUCTURA: HMMER * hmmbuild moldes.hmm moldes.aln * hmmcalibrate moldes.hmm * hmmalign moldes.hmm todas.fa> moldes_hmmer.aln
84 Programas y comandas utilizadosMODELLER MULTI-CHAIN 1. Separar las cadenas (PDBtoSplitChain) 2. Alinear cada una de las cadenas (clustalW) 3. Generar fichero .pir Una vez alineadas las cadenas, incluirlas en el .pir. Cada cadena debe estar separada con /. En la cabecera hay que indicar: nº primer residuo: nombre primera cadena: número de último residuo de última cadena: nombre última cadena. 4. Generar fichero .fa Hay que generar un fichero fasta que incluya todas las cadenas que hay en el pdb 5. Generar fichero .py Poner nombre de fichero .pir; poner nombre del pdb; poner nombre de la secuencia fasta 6. Ejecutar el modeller: mod9v7 prueba.py
85 Programas y comandas utilizadosSTAMP 1. Crear archivo .domains (moldes.domains), donde pondremos las cadenas de los pdbs que nos interesan para el stamp. 2. Hacer el stamp: stamp–l moldes.domains-rough -n 2 –prefix moldes >moldes.out Se nos generan archivos moldes.1, moldes Y el moldes.out, que nos explicará cómo ha agrupado los pdbs con sus RMSD correspondientes. 3. Convertimos el formato de alineamiento del archivo moldes.x que nos interese (1, 2, 3…) a un formato clustalW: aconvert-in b -out c
86 Programas y comandas utilizadosPROSA Shell prosa Read pdb ejemplo1.pdb obj1 Read pdb ejemplo2.pdb obj2 Analyse energy * plot winsize * 30 Color * obj1 red Color * obj2 blue
87 Programas y comandas PYDOCK adminBE@luke:~/test/work> pydock$ pydock T26 setup Un fichero que contenga: #!/bin/bash #$ -S /bin/bash #$ -q llicen.q #$ -o /homes/users/adminBE/test/work/send.o #$ -e /homes/users/adminBE/test/work/send.e cd /homes/users/adminBE/test/work source /cursos/BE/programari/bashrc_luke pydock T26 zdock pydock T26 rotzdock pydock T26 dockser pydock T26 patch $ qsub
89 PEM 1. Referente al pydock:Funciona sin necesidad de introducir la comanda: $ pydock (fichero.ini) setup En el fichero .ene podemos ver las energías de docking Las dos anteriores son correctas Resulta imposible generar un PDB del docking Todas las anteriores son correctas 2. Referente a los aminoácidos: La valina, la leucina i la alanina son aminoácidos hidrofóbicos La arginina y la lisina son aminoácidos cargados La treonina i la serina son aminoácidos polares
90 PEM 3. Respecto a los programas de visualización de proteínas:Con Rasmolpodemos marcar enlaces de hidrógeno Con VMD podemos marcar un aminoácido concreto Las dos anteriores son correctas Con VMD calculamos energías de docking Todas las anteriores son falsas 4. El TGN1412: Es un fármaco diseñado para el tratamiento de la artritis reumatoide Es una molécula con plegamiento de tipo todo-beta Es un fármaco que ya está en el mercado Todas las anteriores son correctas
91 PEM 5. Marca las afirmaciones correctas:1. La RMN te permite determinar la estructura terciaria de la proteína 2. La microscopía electrónica te genera imágenes en tres dimensiones 3. El dicroísmo circular sólo te permite ver la estructura secundaria de la molécula 4. Los rayos X te permiten determinar la estructura de la proteína en solución 1, 2 y 3 2 y 4 1 y 3 1, 2, 3, 4 4 6. Señala la opción correcta: STAMP nos permite hacer alineamiento por estructura Con ClustalW podemos hacer alineamientos por secuencia Las dos anteriores son correctas Modeller necesita un alineamiento tipo.pir para actuar Todas las anteriores son correctas
92 PEM 7. Señala la respuesta correcta con respecto al Modlink:Se usa para encontrar los homólogos más cercanos de una proteína El mejor resultado es el que tiene E-value de mayor valor Se usa para encontrar homologías lejanas Es útil para visualizar proteínas Se usa para unir (link) varios modelos (Mod) en un solo PDB 8. Señala las respuestas correctas: La ley de Lambert-Beer sirve para determinar la energía de enlace En el interior de una proteína predominan los residuos hidrofóbicos El efecto hidrofóbico se rige por la ley de Coulomb La energía de Van der Waals favorece que se superpongan los átomos Todas las anteriores son falsas El que ens plantegem a la hipòtesi 3 és que potser la resposta immune podria haver estat deguda a que el fàrmac (TGN1412) podira haver reaccionat amb ell mateix, formant agregats que precipiten. El que vam fer per a estudiar aquesta hipòtesis va ser analitzar les possibles interaccions entre les diferents cadenes del TGN1412 amb el pyDock. Vam analitzar tres posibles interaccions: de la cadena lleugera amb ella mateixa, un altre de la cadena pesada amb ella mateixa i un altre de la cadena pesada amb la lleugera. De cadascun dels pyDocks vam obtenir una taula amb l’energia total de la interacció.
93 PEM 9. Señala las moléculas que pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas: TGN1412 CTLA4 Las dos anteriores CD28 Todas las anteriores 10. Sobre las bases de datos: Swissprot contiene secuencias de proteínas Con PDB podemos obtener estructuras 3D de proteínas Las dos anteriores son correctas Con SCOP no podemos obtener información estructural sobre familias proteicas Todas las anteriores son ciertas El que ens plantegem a la hipòtesi 3 és que potser la resposta immune podria haver estat deguda a que el fàrmac (TGN1412) podira haver reaccionat amb ell mateix, formant agregats que precipiten. El que vam fer per a estudiar aquesta hipòtesis va ser analitzar les possibles interaccions entre les diferents cadenes del TGN1412 amb el pyDock. Vam analitzar tres posibles interaccions: de la cadena lleugera amb ella mateixa, un altre de la cadena pesada amb ella mateixa i un altre de la cadena pesada amb la lleugera. De cadascun dels pyDocks vam obtenir una taula amb l’energia total de la interacció.