1 “Arrays de cDNA” Curso de Postgrado Genómica, Proteómica y Bioinformática (Enero-06)Carles J. Ciudad. Grupo de Terapia anticancerosa. Departamento de Bioquímica I Biologia Molecular. Fac Farmacia. UB.
2 Una Vieja Idea con una tecnología modernaDeterminar la expresión génica a mRNA Un Array es un Multi-Northern Técnica basada en la hibridación Arrays ( genes), tamaño grande. Marcaje radiactivo Microrarrays (hasta 40,000 genes) micro. Marcaje fluorescente
3 APLICACIONES DE LOS ARRAYSDEFINIR PERFILES DE EXPRESIÓN GENICA (EN DIFERENTES TEJIDOS, ESTADOS DE DESARROLLO, TRATAMIENTOS: complementar funcionalmente el proyecto genoma humano) ESCRUTINIO DE MUCHOS GENES SIMULTÁNEAMENTE (ventajas respecto RT-PCR, RNAse protection, Northern analysis) INVESTIGAR PROCESOS NORMALES Y PATOLÓGICOS (comparación de tejidos) DESCUBRIR DIANAS TERAPÉUTICAS
4 PLATAFORMA BD-CLONTECH DISPOSICIÓN GENES
5 NATURALEZA DE LOS ARRAYSLO CONSTITUYEN CENTENARES DE cDNAs INMOBILIZADOS SOBRE MEMBRANAS DE NILÓN (8X12cm) CARGADAS POSITIVAMENTE (dup o singli) CADA cDNA CONTIENE bp, (10ng) (AMPLIFICADAS DE REGIONES DE mRNA SIN COLA DE POLI-A, ELEMENTOS REPETITIVOS O ALTAMEN-TE HOMÓLOGOS, Y QUE NO HIBRIDEN CON OTRAS SECUENCIAS DE GENES PRESENTES EN EL ARRAY) SON ESPECÍFICO DE ESPECIE CONTIENEN CONTROLES NEGATIVOS (PLÁSMIDOS,BACTERIOFAGOS), Y POSITIVOS (HOUSEKEEPING GENES) QUE PUEDEN UTILIZARSE PARA NORMALIZAR
6 METODOLOGÍA d’ARRAYS - EXTRACCIÓN DE RNA (poliA o total)* comprobar la calidad - SÍNTESIS DEL cDNA Y MARCAJE * MMLV-RT * a-[32P]-dATP ó a-[33P]-dATP * Primers específicos (1176) - PURIFICACIÓN DE LA SONDA * sephadex G-50 - HIBRIDACIÓN * DNA inespecíficos * 68ºC OVN - LAVADOS * hasta 0,5 XSSC, 0,5% SDS - CONTACTAR CON PLACAS DE EUROPIO (días) - ANÁLISIS, NORMALIZACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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10 POLI A+ o RNA TOTAL
11 Normal vs Diabético (Arrays de 8000 genes)
12 NORMALIZACIÓN EN LOS ARRAYSLAS MEMBRANAS PUEDEN MOSTRAR DIFERENTES GRADOS DE HIBRIDACION DIFERENCIAS EN LA CALIDAD DEL RNA O EN LA SINTESIS DE LOS cDNAs NORMALIZACIÓN UTILIZANDO HOUSEKEEPING GENES NORMALIZACIÓN UTILIZANDO TODOS LOS GENES DEL ARRAY (GLOBAL NORMALIZATION)
13 CUANDO SE CONSIDERAN DIFERENCIAS SIGNIFICATIVAS ?GENERALMENTE CUANDO HAY DIFERENCIAS DE 2 o MAS VECES (INCLUSO MENOS DE 2 VECES EN EL CASO DE MENSAJES SOBRE-ABUNDANTES) EN EL CASO DE CAUSAR REDUCCIONES DE LA EXPRESIÓN (ALREDEDOR DE 0.5 VECES)
14 (Leucemia mieloide crónica)Genómica de la resistencia al MTX K562 (Leucemia mieloide crónica) HT29 (Cáncer de colon) I. Análisis genómico de los cambios de expresión II. Identificación de posibles dianas para el diseño de quimiosensibilizadores en la terapia con Metotrexato
15 Dosis respuesta al MTX en K562
16 CUANTIFICACIÓN DE LOS RESULTADOS DE LOS EXPERIMENTOS CON ARRAYS
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19 GeneSpring (Silicon Genetics/Agilent)7.2
20 ARRAY SCATTERING.CNT
21 ARRAY SCATTERING.MTX
22 LIST-OVER 2
23 Clasificación Funcional
24 TREE-DOSE RESPONSE MTX
25 COMPROBACION DE LOS RESULTADOSRT-PCR CUANTITATIVO (En genes con diferencias de 2-5 veces >70% positivos; en superiores a 5 veces >90% positivos) NORTHERN ANALYSIS RNAse PROTECTION WESTERN ANALYSIS ANALISIS DE PROTEINAS EN 2D
26 Expresión de la IMPDH en células K562 tratadas con Mtx 24h Validación de los resultados por RT-PCR cuantitativa IMPDH2 APRT MTX (M) CNT 3x10-8 M 3x10-7 M 50 100 150 200 250 300 Niveles de mRNA para la IMPDH (% respecto el control)
27 Sonda Taq-Man
28 SÍNTESIS DE NUCLEÓTIDOS PÚRICOSADENILSUCCINATO LIASA ADENILSUCCINATO SINTETASA ADENILSUCCINATO AMP IMP IMPDH XANTILATO GMP INHIBIDORES DE LA IMPDH O OH CONH2 BENZAMIDA RIBÓSIDO CH3 HO O O OH S N CONH2 TIAZOFURINA HO O O CH3O CH3 ACIDO MICOFENÓLICO
29 BENZAMIDA RIBÒSID BENZAMIDA RIBÒSID (M)CÈL.LULES RESISTENTS A 10-7 M DE MTX 2 4 6 8 1 C O N T R L - 7 M 3 X 5 BENZAMIDA RIBÒSID (M) + B
30 Plataforma ABI
31 ABI-Arrays
32 Equipo ABI
33 Plataforma Affymetrix
34 Arrays de Affymetrix (Alta densidad)
35 Ampliación Array Affymetrix
36 Arrays fotolitográficos
37 Detalles Técnica Array Affymetrix
38 Hibridación Array Affymetrix
39 Detección Array Affymetrix
40 Tipos de Arrays de Affymetrix
41 Types of Genome Microarrays by Affymetrix
42 GeneChips Human Genome Arrays
43 Detector Affymetrix
44 Microarray Affy HGU133A.2 (22.000 genes)
45 Microarray Affy HGU133A.2 (2-fold)
46 Microarray Affy HGU133A.2 Plus(Chromosome view-4 fold)
47 Curated pathways - Translation Factors
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49 Microarray Affy HG U133A.2 plus (54.000 genes)(full genome)
50 Microarray Affy HGU133A.2 plus (4-fold)
51 4-fold list
52 DHFR
53 Software for curated pathways analysis and generation of BANs (Biological Association Networks)
54 For this example open Microsoft exceland enter the following gene symbols. Then copy this list. This is a list of genes that are differentially expressed based on microarray experiments
55 Build BAN
56 1. Find putative regulators2. Set Filters Filter to include only expression regulation interactions
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58 NLP (Natural Language Processing)
59 Common regulators AKR1C1
60 Sumario Estudios de Genómica Funcional para detectar dianas terapéuticas con que sensibilizar el tratamiento con Metotrexato Macroarrays (1,2K) ---> Microarrays con todo el Genoma (54K) Métodos de Deteción de Dianas: Listados de Genes Diferencialmente Expresados (GeneSpring) Clasificación por Gene Ontology (GO) Curated Pathways (KEGG, GeneMAPP, PathwayAssist) BANs (Biological Association Networks) (PathwayAssist, Ingenuity) Validaciones: RNA Proteína Actividad Funcionales: Inhibidores Químicos Moléculas Antisentido (Oligonucleótidos Antisentido, RNA interferencia)