1 AU1 - Formación del Ser HumanoUniversidad Nacional de La Matanza Ciencias de la Salud - MEDICINA AU1 - Formación del Ser Humano Aplicaciones del diagnóstico molecular en Genética Dra. Mariana Herrera

2 DESORDENES MONOGÉNICOSAparecen cuando un gen está alterado en todas las células del organismo Las alteraciones se deben a mutaciones genéticas que son cambios en las secuencias de los nucleótidos de la cadena de ADN HERENCIA AUTOSÓMICA DOMINANTE HERENCIA AUTOSÓMICA RECESIVA HERENCIA LIGADA AL X HERENCIA MITOCONDRIAL

3 Patrones de herencia de una enfermedad monogenica

4 Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología MolecularOriginadas por la sumatoria de efectos aditivos de varios genes y de factores ambientales que las favorecen La recurrencia en un grupo familiar se establece en función de tablas estadísticas específicas de cada desorden. Enfermedades de origen poligénico analizables por Biología Molecular Diabetes juvenil Alzheimer Enfermedad celíaca Enfermedad cardiovascular Parkinson

5 PCR: reacción en cadena de la polimerasaAMPLIFICACION DEL ADN PCR: reacción en cadena de la polimerasa Ciclos: -Desnaturalización -Hibridación -Elongación ADN total Taq polimerasa Mg Buffer Primers

6 Pocas copias de un fragmentoMillones de copias PCR 10 rep 20 rep 20 rep 10 rep

7 Separación de las cadenas Desnaturalización5’ 3’ DNA diana 3’ 5’ Separación de las cadenas Desnaturalización Forward primer 5’ 3’ Pegador de los primers (annealing) 5’ 3’ 3’ 5’ Reverse primer Hacer copias (extensión)

8 Las copias de PCR se incrementan exponencialmente con el número de ciclosThermal cycle Thermal cycle Thermal cycle En 32 ciclos se hacen más de 1000 millones de copias (2 n = 2 32 copias)

9 Ejemplos de diagnósticos que se hacen por PCR (monogénicas)- Distonía de torsión temprana (autosómica dominante) Ataxia de Friedreich (autosómica recesiva) Enfermedad de Duchenne (ligada al X)

10 Se amplifica un fragmento de 250 pares de bases que contiene al triplete GAG con una PCR radiactiva y se corre en un gel de poliacrilamida.

11 Distonía primaria (PTD)Ctrol N/M Padre Madre Hijo Hija 250 pb 247 pb Se han descripto numerosos casos de aparición de novo de esta deleción

12 Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidosMicrosatélites Son repeticiones de di, tri o tetranucleótidos un número n de veces dinucleótidos: ---ATATATAT(AT)n--- ---CGCGCGCG(CG)n trinucleótidos: ---CAGCAGCAG(CAG)n--- ---CCTCCTCCT(CCT)n--- tetranucleótidos: --(CATG)n-- ó --(CCGG)n-- Características: -Hay alelos con distinto número de repeticiones -Se heredan mendelianamente -Muchas enfermedades neurológicas se originan por un incremento anormal del número de repeticiones

13 Southern Blot Extracción de una gran cantidad de ADN genómico totalDigestión con enzimas de restricción Corrida electroforética Transferencia a una membrana de nylon Identificación de una zona específica del ADN con sondas marcadas Se usa en diagnósticos de enfermedades como la Distrofia Miotónica.

14 FUNDAMENTOS DE LA TECNICA DE Southern BlotCorte mediante enzimas de Restricción.

15 SOUTHERN BLOT

16 Distrofia Miotónica (DM)

17 Secuenciación del ADN Manual o automáticaPCR con nucleótidos especiales Permite conocer la secuencia exacta de pares de bases en un fragmento de ADN

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21 Tecnología de MicroarraysEstá basada en la idea de Southern de que moléculas de ADN marcadas pueden ser usadas para analizar otras moléculas de ADN unidas a un soporte sólido El “Southern blot” fue el primer array Análisis de expresión hibridando moléculas de ARNm a librerías de ADNc sobre membranas de nylon Dot-blot con sondas ASO

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23 Paneles de riesgo para enfermedades complejas:-Enfermedad arterial coronaria -Infarto de miocardio -Fibrilación auricular -Cuadro trombótico -Enfermedad arterial periférica Estudio de portadores de mutaciones recesivas (Panel Ashkenazi): Tay Sachs, Canavan, Gaucher, Galactosemia, Disautonomía Familiar, Bloom, Nieman Pick, Fibrosis Quística, Mucolipidosis, etc.

24 Al leer el informe de un estudio genético:¿Qué mutación/es se estudió/aron? Si no se encontró ninguna mutación, ¿se puede descartar la enfermedad? ¿Qué técnicas se usaron? ¿Es la técnica adecuada para el/la paciente? ¿Cuál es el grado de informatividad del estudio? ¿Existe una buena correlación genotipo/fenotipo?

25 DIFERENCIAS ENTRE POLIMORFISMO Y MUTACIÓN94% 99.9% 0.1% 6%

26 -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia Polimorfismo de longitud -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- -----(GATA)(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )---- A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

27 ¿Cómo se transmiten los caracteres hereditarios de generación en generación?Padres Hijos

28 n 2n n + La Herencia de los Genes. La Fecundación + =Organismo unicelular. Embrión ESPERMATOZOIDE ÓVULO 23 CROMOSOMAS 23 CROMOSOMAS 23 PARES DE CROMOSOMAS HIJO

29 La herencia de los genesGen de “la bondad” GAMETAS FEMENINAS GAMETAS MASCULINAS

30 “mucha bondad” Gen de “la bondad” “mediana bondad” “poca bondad”“excesiva bondad” Gen de “la bondad” Cada variante se denomina alelo. Imaginando este ejemplo, el gen de “la bondad” presenta cuatro alelos: “mucha bondad” “mediana bondad” “poca bondad” “excesiva bondad”.

31 “La bondad” de un hijo es el resultado de la interacción de los genes de la bondad que recibió de sus progenitores.

32 Gen “La bondad” Gen “La Inteligencia” Gen “La Belleza”Variantes Alélicas Mucha Bondad Gran Inteligencia Extremada Belleza Mediana Bondad Inalcanzable Inteligencia Amigable Belleza Poca Bondad Incomparable Inteligencia Mínima Belleza Excesiva Bondad

33 En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

34 Cuando más loci o genes se investiguen mayor será la caracterización de la persona y menor será la posibilidad de encontrar dos personas que compartan exactamente las mismas características. Los estudios de identificación biológica permiten determinar la huella propia de un individuo y reconocer el 50 % heredado de la madre y el 50 % heredado del padre.

35 Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”Un fragmento de ADN se repite n veces “en tandem”. El número de repeticiones en que se encuentra se corresponde con un alelo. Los STRs Locus preciso De acuerdo a las leyes de la herencia, cada individuo tiene dos alelos, uno heredado de su madre y el otro de su padre Se observan alelos de 2, 3, 4, 5 y 6 repeticiones entre los individuos.

36 Los dos alelos de un STR de un individuoPequeñas cantidades de ADN Grandes cantidades de ADN Los dos alelos de un STR de un individuo PCR 10 rep 20 rep 20 rep 10 rep

37 Material biológico a partir del cual pueden realizarse los estudios de identidad.Infinitas divisiones celulares Óvulo materno + espermatozoide paterno El niño tiene en todas las células de su organismo la misma información genética que en la célula originaria Puede utilizarse cualquier tejido para analizar su ADN.

38 Estudio de Paternidad. P+H+M Toma de muestras: sangre, cepillado bucal o uñas LABORATORIO FORMULARIO Nombre completo Fecha de nacimiento Nro. de Documento Relación con el Probando Huella digital Foto Firma Preparación del ADN de las tres personas P H M

39 ESTUDIO DE PATERNIDAD EN SECUANCIADOR AUTOMÁTICO

40 ESTUDIO DE MATERNIDAD

41 Herencia del Cromosoma Y Estudio de la Línea PaternaTodas las células masculinas tienen un cromosoma sexual X y uno Y (XY) Todas las células femeninas tienen dos cromosomas sexuales X (XX) Las gametas femeninas (óvulos) llevan siempre un único cromosoma X Las gametas masculinas (espermatozoides) llevan o un cromosoma X o un cromosoma Y + X X MUJER X X Y + Y X VARON

42 Herencia del Cromosoma YX X X Y X Y X X X Y X X X Y X Y ABUELO, HIJOS VARONES, NIETOS VARONES, HERMANOS VARONES, PRIMOS VARONES POR VIA PATERNA, TIO PATERNO Y SOBRINO, COMPARTEN EL MISMO CROMOSOMA Y

43 espermatozoide + óvulo fecundaciónEl ADN mitocondrial presenta pequeñas regiones diferentes entre las personas mitocondrias núcleos espermatozoide + óvulo fecundación Primer célula embrionaria que originará todo el embrión

44 Herencia Mitocondrial Estudio de la Línea MaternaDNA MIT.1 DNA MIT.2 DNA MIT.3 DNA MIT.5 DNA MIT.1 DNA MIT.1 DNA MIT.4 DNA MIT.5 DNA MIT.1 DNA MIT.1

45 POLIMORFISMO DE UN GEN Está dado por las diferentes variables en que se presenta en la población.

46 -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- TIPOS DE POLIMORFISMO Polimorfismo de secuencia Polimorfismo de longitud -----AGACTAGACATT---- -----AGATTAGACCTT---- -----(GATA)(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)---- -----(GATA)(GATA)(GATA )(GATA )---- A los polimorfismos debidos al cambio de una base por otra en la cadena del ADN se los denomina Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs).

47 En cada individuo este grupo de genes puede presentarse con diferentes combinaciones.

48 Los seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genomaLos seres humanos compartimos el 99,9% de nuestro genoma. Las diferencias responden a variaciones en tan solo el 0.1 % de la secuencia del ADN. DIFERENTES ALELOS EN LA POBLACIÓN

49 PROYECTO GENOMA HUMANOA partir de la secuenciación completa del genoma humano se ha determinado que existen aproximadamente genes. Se encontraron más de sitios con SNPs Pero lo importante fue entender cómo las diferentes variantes alélicas de un gen polimórfico se relacionan con características particulares de las personas. AAACCGG Bondad alta AAAACGG Bondad media TTTGGCC TTTTGCC Proyecto Genoma Humano GWAS (Genomic wide association studies)

50 Farmacogenética LA EFICACIA TERÀPEUTICA DE UN FARMACO DE PRIMERA LINEA NO ES SIEMPRE LA DESEADA. El promedio de eficacia es del 50%.

51 Incremento del riesgo fatal (anual)Farmacogenética: reducción de riesgos de la terapia Comparación de riesgos fatales Incremento del riesgo fatal (anual) 1 en 107 1 en 106 1 en 105 1 en 104 1 en 103 1 en 102 Electrocución Accidente aéreo Asesinato Accidente de coche The internal communications team: ... Farmacogenética Reacción fatal frente al fármaco prescrito Fuente: Consumer Reports

52 El genotipo: impacto significativo en el metabolismo de fármacos Concentraciones de fármaco según Fenotipo Metabolizador Fenotipo metabolizador Genotipo Tipo de respuesta a dosis típicas Ultrarrápido = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Conc. Tiempo = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Eficiente Actividad normal Actividad reducida Por ejemplo pueden predecir los siguientes comportamientos de acuerdo a los resultados obtenidos. Metabolizadores ultrarápidos: poseen múltiples copias (3-13) de los alelos funcionales y generan un exceso de actividad enzimática Metabolizadores rápidos: poseen uno, y no mas de dos alelos funcionales normales Metabolizadores intermedios: poseen un alelo de actividad reducida y un alelo nulo Metabolizadores lentos: poseen dos alelos mutantes que generan la pérdida completa de actividad enzimática = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo Intermedio no actividad Lento = Reacciones adversas = Intervalo terapéutico = No efectivo

53 Consecuencias de un polimorfismo genético:La presencia de uno u otro polimorfismo PUEDE RESULTAR INDIFERENTE. Si afectan a la secuencia codificante PUEDEN PRODUCIR cambios importantes en la estructura de la proteína. Si afectan a la secuencia reguladora del gen PUEDEN MODIFICAR su expresión. Los polimorfismos genéticos también llamados variaciones genéticas se relacionan, entre otras cosas, con el metabolismo de los medicamentos antineoplásicos e influyen en su toxicidad y respuesta a la quimioterapia en pacientes con cáncer.

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55 TIOPURIN METIL TRANSFERASA: TPMT

56 Thiopurine Methyltransferase (TPMT) Gene

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58 Inherited differences in Metabolismmut/mut wt/mut wt/wt Optimal Dose for Each Child Gene for TPMT has A common variant that Causes low activity, High levels of 6MP Metabolites Inherited differences In drug levels Relling & Dervieux Nature Ca Rev 2001;1:99-108

59 UDP-glucuronosiltransferasa UGT1

60 Drogas que presentan en sus prospectos la recomendación por la FDA De estudio farmacogenético antes de medicar. ENZIMA POLIMORFISMO FARMACO CONSECUENCIA UDP-glucuronosiltransferasa UGT1 Secuencias TA repetidas Irinotecan Inestabilidad proteica. Diarrea, mielo depresión. Dihidropirimidina Deshidrogenasa (DPD) Mutación Puntual Fluoropirimidinas Neurotoxicidad, mielo depresión.

61 REACCIÓN AL MEDICAMENTONombre del medicamento Análisis genético para: Resultados del análisis Abacavir Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5701 se asocia a mayor riesgo de presentar hipersensibilidad al abacavir. Antibióticos aminoglucósidos Pérdida auditiva Polimorfismo asociado a la pérdida auditiva como consecuencia del tratamiento con antibióticos amigo glucósidos. Cafeína Metabolismo Polimorfismo asociado a ser metabolizador lento de la cafeína, y riesgo de toxicidad y riesgo de sufrir un infarto cardíaco. Carbamazepina Hipersensibilidad El alelo HLA-B*5702 está asociado a la hipersensibilidad a la carbamazepina. Clopidogrel Metabolismo Polimorfismo asociado a la respuesta. Metotrexato Toxicidad Polimorfismo asociado a riesgo de toxicidad inducida por el metotrexato.

62 LAS PREDICCIONES YA ESTÁN HECHASQUÉ FALTA PARA APLICAR ESTOS ESTUDIOS PREVIO AL TRATAMIENTO? Pacientes con genotipos tratados de acuerdo a las predicciones. Pacientes sin genotipos y tratamiento clásico La farmacogenética, mejora la efectividad del tratamiento?

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64 EJEMPLOS DE ASOCIACIONES GENÉTICASGEN PPARG (PEROXISOME PROLIFERATOR ACTIVATED RECEPTOR GENE) -El alelo C codifica para una Prolina en el codon 12 en lugar de una Alanina. -PPARG asociado a la reducción de el peso corporal en respuesta a la restricción calorica. -Polimorfismo Pro12Ala asociado a Sindrome Metabolico, Resistencia a la Insulina y diabetes tipo 2 en población sana. GEN APOA-2: GEN DE LA APOLIPOPROTEINA A2 -Presencia de una C en lugar de una T en el promotor del gen. -Genotipo C/C : -Influye en la obesidad y el riesgo cardíaco. GEN ADIPOQ: GEN DE LA ADIPONECTINA -Presencia de una G en lugar de una A en la posición G/A, en el gen ADIPOQ. -Tendencia a recuperar el peso perdido inmediatamente. -Riesgo de Resistencia a la insulina y syndrome metabolico. -Alelo A da protección a la recuperación del peso luego de semanas luego de dieta baja en calorías. GEN MCM6: minichromosome maintenance complex component 6. -El a alelo C en lugar del T en la posición del gen MCM6. -Influye sobre el gen LCT y se asocia a hipolactasia o intolerancia a la lactosa.

65 EJEMPLO / REACCIONES A ALIMENTOSINTOLERANCIA A LA LACTOSA La intolerancia a la lactosa es la capacidad de digerir la lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche y los productos lacteos. Esta condición se debe a la falta de una enzima llamada lactasa. La variante genética rs está situada cerca del gen de la lactasa (LCT), en el gen MCM6, y se ha demostrado que nivela los niveles de lactasa en el organismo . Las personas con el genotipo C/C (marcador genético rs ) tienen una “Mayor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa, mientras que las personas con otro genotipo tienen una “Menor probabilidad” de ser intolerantes a la lactosa. Esta variante se ha asociado con la intolerancia a la lactosa en estudio de personas caucásicas, mientras que otras variantes podrían tener un papel importante en otros grupos étnicos. SU RESULTADO MAYOR PROBABILIDAD Las personas con su mismo genotipo tienen un probabilidad mayor de ser intolerantes a la lactosa y pueden sufrir efectos secundarios al ingerir lactosa, que es el azúcar que se encuentra en la leche. GENES RELACIONADOS Gen analizado Su Genotipo Valor Científico MCM6-rs498835 C/C ****

66 [PMID ] PMID, acrónimo de «PubMed Unique Identifier», es un número único asignado a cada cita de un artículo de revistas biomédicas y de ciencias de la vida que recoge PubMed. PubMed es un motor de búsqueda de libre acceso a la base de datos MEDLINE de citaciones y resúmenes de artículos de investigación biomédica. Ofrecido por la Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos como parte de Entrez. MEDLINE tiene alrededor de revistas publicadas en Estados Unidos y en más de 70 países de todo el mundo desde 1966 hasta la actualidad.

67 EJEMPLO / NECESIDADES NUTRITIVASVITAMINA B12 En múltiples estudios genéticos se ha identificado a un marcador en el gen FUT 2, que está asociado a niveles bajos de Vitamina B12 en sangre. Esto se puede deber a una absorción deficiente de la vitamina en el intestino. Se recomienda a las personas con genotipos G/G o A/G “Ajustar el consumo” porque es probable que tengan niveles bajos de Vitamina B12. El consumo de cereales enriquecidos con vitamina B12 puede ayudar a obtener niveles adecuados, sobre todo en personas mayores de 50 años. Las personas con este mismo genotipo tienen mayor probabilidad de presentar niveles mas bajos de vitaminas B12 en sangre. Se puede ajustar el consumo de la vitamina B12 poniéndole ingiriendo alimentos ricos en vitamina B12. GENES RELACIONADOS Gen analizado Su Genotipo Valor Científico FUT2-rs602662 A/G ****

68 ASOCIACIÓN ENTRE LOS NÍVELES DE VITAMINA B12 EN PLASMA CON LOS GENOTIPOS DEL GEN FUT2. (MUJERES DEL GWAS Y REPLICA EN OTROS ESTUDIOS) SNP Association by Study EDAD N FRECUENCIA DEL ALELO CANTIDAD PG/ML ESTIMADO (S.E.) P-VALOR Gly=0.49 Ser/Ser A/A Ser/Gly G/A Gly/Gly G/G AJUSTE EL CONSUMO rs602662GWAS NHS CGEMS , (0.01) x10-10 Total (Gwas+ Grupo replica) x10-15

69 Ante la necesidad de un estudio genético:-La información siempre debe estar mediada por el médico. -Es el médico quien debe asesorar al paciente respecto de las conveniencias y los riesgos de someterse a una prueba genética. -Explicar muy bien el significado de un estudio de asociaciones. --No caer en la GENOMANÍA. -Recordar que la genética es sólo una parte de lo que somos fenotípicamente y que el medio ambiente juega un rol importantísimo tanto en la expresión de nuestros genes (epigenética) como en los riesgos de desarrollar enfermedades complejas (cáncer, diabetes, enf. Cardíaca, etc).

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