1 BIODIVERSIDAD Y BIODEGRADACIÓNIntroducción Mecanismos de evolución y adaptación Ejemplos

2 PROCARIOTAS en la biosferaHay de 4-6 x 1030 células de procariotas Su biomasa es muy superior a la biomasa de eucariotas 90% de los procariotas se encuentran en el SUBSUELO 10% en SUELOS, SEDIMENTOS, MASAS DE AGUA, AIRE, EUCARIOTAS Mucha BIODIVERSIDAD Estimación del nº de especies bacterianas: entre y > 1 billón (109) Existen desde hace cerca de 3,5 G-años (las plantas existen desde hace 600 millones de años)

3 Estabilización de la cortezaWoese, 1994 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 Homo sapiens Caballo Dinosaurios Trilobites procariotas Formación de la tierra Estabilización de la corteza Atmósfera de oxígeno Billones de años • Sin embargo, sólo unas 6000 especies descritas, frente a más de 1 millón entre animales y plantas, o ca. 1 millón de especies de insectos. ¿PORQUÉ? Pequeños, simples, dificultad cultivo puro, pocos estudios taxonómicos, ...

4 Número de procariotas en habitats acuáticosHábitat Volumen, Celulas/ml Nº total de celulas cm × × 1026 Marino Plataforma continental × Océano abierto Agua, por encima de 200 m 7.2 × Agua, por debajo de 200 m × Sedimento, 0-10 cm 3.6 × Dulce Lagos × Rios × Lagos salinos × Total x 1026 Whitman et al., 1998

5 Número de procariotas en el sueloTipo de ecosistema Area, No. of cells, × 1012 m × 1027 Selva tropical lluviosa Selva tropical pluviestacional Bosque templado esclerófilo Bosque templado caducifolio Bosque boreal (taiga) Bosques y arbustedas Sabana Praderas templadas Matorral desértico Tierras cultivadas Tundra y vegetación alpina Pantanos y zonas húmedas Total x 1027

6 Número total de procariotas en sedimentos subsuperficiales no consolidados (por debajo de 10 m) Nº de células, × 1028 Intervalos de Cells/cm3 Océanos Plataforma Planicies profundidad (m) × profundos continental costeras Total Grand Total: 380 × 1028 = 3.8 × 1030

7 APROXIMACIONES AL ESTUDIO DE LA BIODIVERSIDAD BACTERIANA¿Quién está ahí? CULTIVOS (puros) ESTUDIO DE COMUNIDADES OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO Estudios fenotípicos: muy limitados Secuencias  grandes cambios en la taxonomía bacteriana %GC 16S  Árboles filogenéticos Análisis de fosfolípidos u otros marcadores Inconvenientes: Hay que cultivar! (VNC) Es posible que sólo detectemos el 1% de los presentes < 5000 especies en colecciones

8 ESTUDIO DE COMUNIDADESMétodos moleculares: aislamiento de ADN total PCR + clonación Análisis de secuencias conservadas (16S) Inconvenientes: Información de secuencia 16S puede NO ser suficiente para delimitar especies < 5000 secuencias de ARNr 16S en bases de datos OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO Muestras fijadas Tinción general Inconvenientes: Información sobre ABUNDANCIA de microorganismos. NO sobre tipos Tinción específica (sondas)  controles muy difíciles Se recomienda utilizar una combinación de todas las aproximaciones.

9 VIABLES PERO NO CULTIVABLESMicroorganismos presentes en la naturaleza pero que NO somos capaces de cultivar en el laboratorio. V. cholerae en habitats “puros” incubadas en agua de mar artificial, permanecían viables pero PERDÍAN la capacidad de formar colonias en medios de cultivo Muchas especies pueden alcanzar un estado de VIABLE, NO CULTIVABLE Fallan los medios de cultivo. ¿Por qué? “Desacoplamiento” entre metabolismo y división celular (daño oxidativo) (atracón) (suicidio microbiológico) SOLUCIÓN: cultivos con restricciones nutricionales

10 Biodiversidad y biodegradación de aromáticos¿Por qué existen bacterias capaces de degradar tolueno y otros compuestos aromáticos, incluso xenobióticos? ¿Cómo son? ¿Cómo se originan?

11 Lignina

12 Meter aquí transparencia 15 de Biodiversidad vamos a hablar de dioxigenasas del anillo C H 3 O - m e t i l c a o O H C p r o t c a e u C O H O H C p r o t c a e u O H

13 DIOXIGENASA DEL ANILLOM c a t D F I C B b e n A H I K Q J F G E T L Z Y X x y l R S N B A M C b d A B C c n a h A d o B C DIOXIGENASA DEL ANILLO b p h A 1 2 3 4 B C E G F D I S P a ß F d R s D H C 2 , 3 O t c b A a d B I S t c b F E D C R c b a A B C I S Van der Meer, 1997

14 Generalidades-ConclusionesPatrones muy conservados de organización cromosómicas de las rutas, aunque se observan reorganizaciones. Flanqueadas por secuencias de inserción en algunos casos. La mayoría son operones. La mayoría están reguladas. En muchos casos se puede predecir la ruta por les genes presentes.

15 ¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza?Capacidad biodegradadora f e n a t r o l OH COOH p-HB ¿Ocurre Biodegradación en la naturaleza? (Madsen et al., 1991) Toma de muestra Carretera Aguas subterráneas Mancha alquitrán U D L 50 m 100 p-HB NAF FEN 50 D U L % Mineralización Abundancia microbiológica D U L 109 106 103 Log cfu viables totales protozoos  Se ha producido una adaptación de las poblaciones autóctonas a hidrocarburos poliaromáticos  Ha habido crecimiento estimulado por el contaminante

16 Evolución natural: RESPUESTA ADAPTATIVACon frecuencia, se observa: Compuesto xenobiótico Comunidad microbiana incapaz de degradarlo. Incubación en presencia del compuesto Pasado un tiempo, se produce mineralización total del compuesto. Ha habido un CAMBIO en la comunidad bacteriana MECANISMOS POSIBLES: inducción de enzimas crecimiento de una subpoblación de la comunidad SELECCIÓN de una subpoblación con propiedades nuevas (adaptación genética) Lleva más tiempo No es reproducible

17 MECANISMOS NATURALES DE EVOLUCIÓNMutación /Selección Mutaciones ocurren AL AZAR El medio selecciona las favorables. Mutaciones puntuales Ocurren al azar, constantemente (dependen de la tasa de crecimiento) Cambio de una base en el ADN Recombinación y transposición Pueden producir reorganización genética. Duplicaciones. (de uno o varios genes, generalmente por recombinación o slippage) Suponen grandes ventajas Elementos de inserción Pueden tener consecuencias varias Transferencia genética Paso de ADN de una bacteria a otra

18 Recombinación y transposiciónMutaciones puntuales mutaciones silenciosas (se acumulan). mutaciones con efecto fenotípico (numerosos ejemplos en el laboratorio) Son la fuente principal de biodiversidad. ATG TTC GGA GGC ACC TTG Gly: GGN Met Phe Gly Gly Thr Leu Proteína A Phe: TTC, TTT Leu: TTG, TTA ATG TTC GGT GGC TTG ATG TTA GGA GGC TTG.... . Met Phe Gly Gly Leu Met Leu Gly Gly Leu Proteína A* Mutación silenciosa Mutación no silenciosa b p h A 1 2 3 4 B C E G F D e n Recombinación y transposición Se observa en rutas conocidas.

19 Duplicaciones. Se observan con frecuenciaMecanismo importante de evolución: no se pierde ninguna función gen A Duplicación gen A Mutación gen A Acumulación de mutaciones gen A gen A gen B Etc...

20 A B C Elementos de inserción. GANANCIA DE FUNCIÓN gen A IS“salto” de un elemento de inserción gen A DESTRUIDO IS A gen A genB “salto” de un elemento de inserción que lleva gen de interés B GANANCIA DE FUNCIÓN gen A EXPRESADO CONSTITUTIVAMENTE “salto” de un elemento de inserción que lleva secuencia promotora C Px

21 Transferencia genéticaPaso de ADN de una bacteria a otra Muy útil en ingeniería de rutas Vehículos: Plásmidos (TOL, NAH, SAL) unidad de replicación independiente Transposones Fagos Existe transferencia génica en la naturaleza - entre poblaciones naturales - entre organismos introducidos y organismos indígenas - ¿Retrotransferencia? gen H I K Q J F G E T L Z Y X x y l R S N B A M C

22 Limitaciones a la diversidadElementos que intervienen en la evolución molecular de procariotas Limitaciones a la diversidad Fuente de diversidad Estrategias de variación Fuentes de mutación Aislamiento Reparación Selección natural Condiciones de vida Entorno fisico-químico Entorno biológico Tamaño de la biosfera (ca células) Errores Polimerasa Diversidad genética Cambios locales de secuencia Agentes mutagénicos Reorganizaciones Recombinación “Reshuffling” Adquisición de ADN Transferencia horizontal

23 INTERCAMBIO DE GENES EN LA NATURALEZAA.- En microcosmos, entre organismos conocidos B.- Entre organismos indígenas y organismos introducidos C.- Entre poblaciones naturales, in situ

24 Transferencia de genes entre Pseusomonas en microcosmosLodos industriales Pseusomonas EB62 Plásmido TOL modificado. Crece en 4-Etilbenzoato. Pseusomonas UWC1 RifR Inocular lodos con las dos cepas Medir supervivencia de las poblaciones Aparición de transconjugantes Indígena 104 108 Log cfu/ml Tiempo (días) 6 12 UWC1 EB62 UWC1/EB62 Añadir 4EB (4 mM) 104 108 Log cfu/ml Tiempo (días) 6 12 Indígena UWC1 EB62 UWC1/EB62

25 Transferencia de genes en el suelo:Obtención de organismos “recombinantes” in situ. Buscamos degradadores de Bifenilos policlorinados (PCBs) Es normal encontrar en la naturaleza degradadores de bifenilo. NO es normal encontrar degradadores de clorobenzoato en la naturaleza. Tenemos Pseudomonas aeruginosa JB2, capaz de degradar clorobenzoato. Queremos ver si esta cepa le puede transferir sus genes a alguna cepa del suelo, o vice versa. Cl n COOH Cl n Muestra de suelo + Bifenilo Aroclor1242 P. aeruginosa JB2 Tomar muestras Sembrar en medios selectivos

26 Estrategia ¿Ocurre en la naturaleza?”INOCULAR” CON EL GEN QUE FALTA Tomar muestras y conteo de dos poblaciones: Degradadores de bifenilo Degradadores de clorobenzoato Picar a bifenilo Cl n OH PCBs Ciclo de Krebs bph COOH clc Esto se ha conseguido en el laboratorio Estrategia P. aeruginosa JB2 Cepa indígena Después de 15 días, empiezan a aparecer cepas capaces de degradar los dos compuestos. 8 son P. aeruginosa JB2 (BIOLOG) Se analizar algunos recombinantes: son INESTABLES 1 es diferente  JB2-M (<78%) La cepa indígena: Pseudomonas sp. AW Tiempo (días) 25 50 Log CFU/g de suelo 5 7 8 6 9

27 C.- Entre poblaciones naturales, in situSitio contaminado con alquitrán (N.Y.) Análisis de la población: Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno Se analiza la población con respecto al gen nahAc Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S

28 transparencia

29 C.- Entre poblaciones naturales, in situSitio contaminado con alquitrán (N.Y.) Análisis de la población: Se aislan 21 cepas Gram – capaces de crecer en naftaleno Se analiza la población con respecto al gen nahAc Se analiza la población con respecto al gen del ARNr 16S Se observa que hay mucha más distancia evolutiva al analizar secuencias 16S que al analizar el gen nahAc  Se deduce TRANFERENCIA HORIZONTAL (reciente).  Datos sugieren que la transferencia de genes también ha ocurrido a grandes distancias (dispersión).  Todas las cepas aisladas llevan un megaplásmido. nahAc se encuentra tanto en plásmido como en cromosoma, o en ambos.

30 ¿Puede mejorar el laboratorio a la naturaleza?