1 Biofizyka makrocząsteczekPeptydy i białka Biofizyka makrocząsteczek

2 Biologiczne układy koloidalne

3 Układ koloidalny Układ koloidalny (koloid, układ koloidowy) – niejednorodna mieszanina, zwykle dwufazowa, tworząca układ dwóch substancji, w którym jedna z substancji jest rozproszona (zawieszona) w drugiej. Rozdrobnienie (czyli dyspersja) substancji rozproszonej jest tak duże, że fizycznie mieszanina sprawia wrażenie substancji jednorodnej, jednak nie jest to wymieszanie na poziomie pojedynczych cząsteczek.

4 Właściwości W koloidach stopień dyspersji wynosi od 105 do 107 cm-1 – wówczas wielkość cząstek fazy zawieszonej (zdyspergowanej) sprawia, że ważne są zarówno oddziaływania pomiędzy nią i fazą dyspergującą, jak i oddziaływania wewnątrz obu faz. Układ dyspersyjny jest układem koloidalnym, gdy rozmiary cząstek fazy rozproszonej (cząsteczek chemicznych lub ich agregatów) albo rozmiary nieciągłości układu koloidalnego są w zakresie od 1 nm do 1 m przynajmniej w jednym kierunku.

5 Składniki układu koloidalnegoTypowy układ koloidalny (tzw. koloid fazowy) składa się z dwu faz: fazy ciągłej, czyli substancji rozpraszającej, zwanej też ośrodkiem dyspersyjnym albo dyspergującym fazy rozproszonej, czyli substancji zawieszonej (zdyspergowanej) w ośrodku dyspersyjnym i w nim nierozpuszczalnej (liofobowej, hydrofobowej).

6 Koloidy cząsteczkowe koloidy cząsteczkowe, gdzie fazą rozproszoną są makrocząsteczki, np. polimery tj. żelatyna, skrobia, białka – nie występuje wówczas wyraźna granica fazowa, bo cząsteczki rozpuszczalnika mogą wnikać do wewnątrz makrocząsteczki większość koloidów cząsteczkowych powstaje w sposób samorzutny w wyniku rozpuszczania w rozpuszczalniku (koloidy liofilowe, hydrofilowe). Niektóre ich właściwości są inne niż właściwości koloidów fazowych.

7 Rodzaje układów koloidalnychOśrodek rozpraszający Substancja rozpraszana Rodzaj Przykład Gaz – Ciecz aerozol ciekły mgła Ciało stałe aerozol stały dym piana piana mydlana emulsja lakier do paznokci, mleko, majonez zol, zawiesina koloidalna (suspensja), roztwór koloidalny Ag kol w H2O piana stała pumeks, styropian emulsja stała opal zol stały (pirozol) szkło rubinowe

8 Makrocząsteczki białkowe

9 Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat:

10 Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat:- struktury makrocząsteczek

11 Fizyczne metody badań dostarczają informacji na temat:- struktury makrocząsteczek - ich konformacji przestrzennej

12 Pojęcia podstawowe STRUKTURA – rozmieszczenie atomów w przestrzeni uporządkowane w sposób periodyczny

13 Pojęcia podstawowe STRUKTURA – rozmieszczenie atomów w przestrzeni uporządkowane w sposób periodyczny BAZA STRUKTURY – niezmienny zespół atomów, który periodycznie powtarzając się tworzy strukturę. Może składać się z jednego (w strukturach prostych) lub z wielu (w makrocząsteczkach) atomów

14 Poziomy uporządkowania strukturyWewnętrzny - bazy struktury

15 Poziomy uporządkowania strukturyWewnętrzny - bazy struktury Zewnętrzny - pomiędzy bazami

16 Pojęcia podstawowe KONFORMACJA(1) – względny rozkład atomów w przestrzeni wynikający z obrotu lub skręcenia wiązań kowalencyjnych

17 Pojęcia podstawowe KONFORMACJA(1) – względny rozkład atomów w przestrzeni wynikający z obrotu lub skręcenia wiązań kowalencyjnych KONFORMACJA(2) – przestrzenna struktura cząsteczki przy praktycznie stałych wartościach: długości wiązań, kątów między wiązaniami

18 Fizyczne metody badania makrocząsteczekmetody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna),

19 Fizyczne metody badania makrocząsteczekmetody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne,

20 Fizyczne metody badania makrocząsteczekmetody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze,

21 Fizyczne metody badania makrocząsteczekmetody rentgenograficzne (analiza rentgenostrukturalna), metody hydrodynamiczne, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze, metody optyczne

22 Analiza rentgenostrukturalnaWykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ

23 Analiza rentgenostrukturalnaWykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ Dyfrakcję promieni X powodują tylko elektrony, stąd rentgenogram pozwala na uzyskanie mapy gęstości elektronowej

24 Analiza rentgenostrukturalnaWykorzystuje zjawisko rozproszenia (dyfrakcji) promieni X przez kryształ Dyfrakcję promieni X powodują tylko elektrony, stąd rentgenogram pozwala na uzyskanie mapy gęstości elektronowej Wymaga substancji oczyszczonych, jednorodnych, występujących w postaci krystalicznej

25 Analiza rentgenostrukturalna4 Ryc. Schemat otrzymywania rentgenogramu: 1 – promień pierwotny, 2 – kryształ, 3 – promienie dyfrakcyjne, 4 - błona fotograficzna 1 2 3

26 Analiza rentgenostrukturalnaMożliwa do zastosowania w badaniach struktur biologicznych dzięki zdolności do krystalizacji białek, kwasów nukleinowych i wirusów.

27 Analiza rentgenostrukturalnaAtomy kryształu tworzą układy częściowo odbijających płaszczyzn – tzw. płaszczyzny sieciowe Ponieważ rozkład refleksów promieniowania x zależy od parametrów geometrycznych sieci krystalicznej, analizę rentgenostrukturalną wykorzystuje się do badania struktury kryształów nisko- i wysokocząsteczkowych

28 Analiza rentgenostrukturalnaRyc. Rentgenogram procesyjny oksyhemoglobiny ludzkiej wykonany w Zakładzie Krystalografii Instytutu Chemii UŁ.

29 Analiza rentgenostrukturalnaRyc. Fragment mapy gęstości elektronowej mioglobiny. Widoczne jest otoczenie hemu (wg. M.F.Perutz)

30 xj, yj, zj Analiza rentgenostrukturalnaParametry położenia atomów w strukturze xj, yj, zj

31 Parametry położenia atomów w strukturzeAmplituda j-tego atomu: gdzie: fj – wielkość zależna od rodzaju atomu, a  - kąt fazowy zależny od pozycji atomu

32 Parametry położenia atomów w strukturzeAmplituda promieni dyfrakcyjnych: gdzie: - moduł amplitudyFoblicza się z równania I = F2

33 Analiza rentgenostrukturalnaRyc. Odbicie promieni x od płaszczyzn sieciowych w krysztale

34 Analiza rentgenostrukturalnaOgraniczenia: Długość fal x musi spełniać warunek Wulfa- Bragga: gdzie: λ – długość fali, m – rząd odbicia, θ – kąt pomiędzy kierunkiem padania promieni a płaszczyzną kryształu, d – odległość między sąsiednimi płaszczyznami sieciowymi

35 Analiza rentgenostrukturalnaOgraniczenia: Warunek konieczny do spełnienia przez fale ulegające dyfrakcji na siatkach przestrzennych , tzn.

36 Analiza rentgenostrukturalnaOgraniczenia: Warunek Wulfa-Bragga i długość fali różnych zakresów promieniowania elektromagnetycznego powodują, że kryształy przepuszczają promienie UV i Vis oraz uginają promienie x, γ oraz elektrony i neutrony.

37 Analiza rentgenostrukturalnaMETODA IZOMORFICZNYCH PODSTAWIEŃ: Jednoczesne wykorzystanie danych dyfrakcyjnych otrzymanych z kryształów kilku pochodnych oznaczanego związku

38 Metody hydrodynamiczneDostarczają przybliżonych danych o wielkości i kształcie makromolekuł w oparciu o właściwości ich roztworów

39 Metody hydrodynamiczneDostarczają przybliżonych danych o wielkości i kształcie makromolekuł w oparciu o właściwości ich roztworów Są mniej dokładne, ale łatwiejsze do wykonania od metod rentgenograficznych

40 Metody hydrodynamicznelepkość,

41 Metody hydrodynamicznelepkość, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze,

42 Metody hydrodynamicznelepkość, dyfuzja makrocząsteczek w roztworze, sedymentacja w wirówce.

43 Lepkość – gradient prędkości cząsteczek w cieczy rzeczywistejRyc. Zachowanie się makrocząsteczki w cieczy, w której występuje gradient prędkości: a – prędkości warstw cieczy względem nieruchomego układu odniesienia, b – prędkość cieczy względem makrocząsteczki M

44 Lepkość – siły wprawiające w ruch obrotowy makrocząsteczki, którego utrzymanie wymaga dodatkowej energii, pochodzącej ze wzrostu lepkości roztworu Ryc. Pary sił działające na cząsteczki o różnych kształtach w gradiencie prędkości cieczy

45 Lepkość dla cząsteczek kulistych (równanie Einsteina)gdzie 0 – lepkość rozpuszczalnika, a  - stosunek objętości cząsteczki do objętości całego roztworu

46 Lepkość dla cząsteczek kulistych (równanie Einsteina)gdzie 0 – lepkość rozpuszczalnika, a  - stosunek objętości cząsteczki do objętości całego roztworu dla cząsteczek o innych kształtach lepkość wzrasta co można wykorzystać do określania przybliżonego kształtu makromolekuł

47 Dyfuzja makrocząsteczek w roztworzeWykorzystuje zależność współczynnika dyfuzji od kształtu i rozmiaru makrocząsteczek gdzie: NA – liczba cząsteczek w jednym molu substancji, η- lepkość i r – promień cząsteczki.

48 Sedymentacja w wirówceSedymentacja - osiadanie cząsteczek zawieszonych w ośrodku dyspersyjnym (rozpuszczalniku) w polu grawitacyjnym lub odśrodkowym

49 Sedymentacja w wirówceRotor Przeciwwaga Kuweta analityczna Oś obrotu Badany roztwór X Ryc. Schemat rotora wirówki analitycznej

50 Sedymentacja w wirówceUmożliwia wyznaczenie mas molowych w oparciu o równanie Svenberga gdzie:  - gęstość rozpuszczalnika współczynnik sedymentacji: , przyspieszenie jednostkowe: , stosunek objętości cząsteczki do jej masy

51 Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla)

52 Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla)Rozpraszanie promieni Rentgena

53 Metody optyczne Rozpraszanie światłą (efekt Tyndalla)Rozpraszanie promieni Rentgena Metody spektrofotometryczne

54 Poziomy organizacji cząsteczki białkaStruktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów)

55 Poziomy organizacji cząsteczki białkaStruktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura )

56 Poziomy organizacji cząsteczki białkaStruktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura ) Struktura trzeciorzędowa (sposób zwinięcia w przestrzeni łańcucha o określonej strukturze drugorzędowej)

57 Poziomy organizacji cząsteczki białkaStruktura pierwszorzędowa (sekwencja aminokwasów) Struktura drugorzędowa (układ przestrzenny głównego łańcucha polipeptydowego, np. -helix, struktura ) Struktura trzeciorzędowa (sposób zwinięcia w przestrzeni łańcucha o określonej strukturze drugorzędowej) Struktura czwartorzędowa (układ przestrzenny podjednostek oraz zespół oddziaływań i kontaktó między nimi

58 Poziomy organizacji cząsteczki białka

59 Geometria wiązania peptydowegoa. Sprzężenie wiązań i częściowe pokrywanie się powłok elektronowych a. Wymiary kątów i poszczególnych wiązań w ugrupowaniu peptydowym

60 Geometria wiązania peptydowego

61 Mechanizm sprzęgania wiązań+

62 Cechy wiązania peptydowegoPodwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem 

63 Cechy wiązania peptydowegoPodwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem  Polarność ugrupowania peptydowego stwarza możliwość występowania konfiguracji cis i trans. Konfiguracja trans jest korzystniejsza energetycznie i bardziej typowa dla otwartych łańcuchów peptydowych

64 Cechy wiązania peptydowegoPodwójny charakter wiązań C’ = N umożliwia swobodną rotację atomów, która wymaga jednak pewnych nakładów energii. Kąt obrotu wokół C’ = N, czyli kąt deformacji oznaczany jest symbolem  Polarność ugrupowania peptydowego stwarza możliwość występowania konfiguracji cis i trans. Konfiguracja trans jest korzystniejsza energetycznie i bardziej typowa dla otwartych łańcuchów peptydowych Ugrupowania peptydowe mogą się ze sobą łączyć wiązaniami wodorowymi

65 Konformacja polipeptydów (założenie podstawowe)Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie

66 Konformacja polipeptydów (założenie podstawowe)Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie Konformację prostych związków organicznych można ustalić w oparciu o mechanikę kwantową

67 Konformacja polipeptydów (założenia podstawowe)Cząsteczki w stanie równowagi termodynamicznej przyjmują konformację najbardziej korzystną energetycznie Konformację prostych związków organicznych można ustalić w oparciu o mechanikę kwantową Celem ustalenia konformacji makrocząsteczek (np. białek), ze względu na ich złożoność, stosuje się metody półempiryczne

68 Energia potencjalna polipeptyduVn – suma energii oddziaływań van der Wallsa, Vt – energia oddziaływania torsyjnego (orientacji wiązań), Vel – energia oddziaływań elektrostatycznych, VH – energia tworzenia wiązania wodorowego, VW, Vk – energia deformacji długości i kątów wiązań, Vhydr – energia hydratacji.

69 Warunki trwałości konformacji łańcucha peptydowego (Pouling, Carey i Branson 1951) Wszystkie aminokwasy wchodzące w skład łańcucha peptydowego muszą należeć do tego samego szeregu konfiguracyjnego Każda wiązanie peptydowe ma konformację płaską (koplanarną) o parametrach typowych dla związków niskocząsteczkowych

70 Warunki trwałości konformacji łańcucha peptydowego (Pouling, Carey i Branson 1951) Grupy C’ = O i N – H tworzą wewnętrzne wiązania wodorowe o długości 0,272nm, odchylające się od lini prostej o kąt nie większy od 30º Ustawienie przestrzenne wiązań C’ – C i C – N odpowiada odpowiada minimalnej energii obrotu wokół tych wiązań

71 Konformacje polipeptydów (a) Heliks- (b) Struktura-

72 Konformacje helikalneHELIX - : 5,1 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º

73 Konformacje helikalneHELIX - : 5,1 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º HELIX - : 3,6 reszt aminokwasowych na 1 zwój; kąt odchylenia wiązania wodorowego od osi heliksu wynosi 10º

74 Charakterystyka  - heliksuŚrednica heliksu wynosi 1,01 nm

75 Charakterystyka  - heliksuŚrednica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm

76 Charakterystyka  - heliksuŚrednica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm Translacja (tzn. przesunięcie wzdłuż osi o 1 resztę aminokwasową wynosi 0,15 nm

77 Charakterystyka  - heliksuŚrednica heliksu wynosi 1,01 nm Odległości między skrętami wynoszą 0,54 nm Translacja (tzn. przesunięcie wzdłuż osi o 1 resztę aminokwasową wynosi 0,15 nm Może być prawo- (dla D-aminokwasów) lub lewoskrętny (dla L-aminokwasów)

78 Prawo- i lewo-skrętny -heliks

79 Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa

80 Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa Antyrównoległa

81 Rodzaje struktury  Struktura  Równoległa Antyrównoległa -cross

82 Struktura  równoległa antyrównoległa

83 Struktura -cross

84 Charakterystyka struktury - Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych

85 Charakterystyka struktury - Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych Wiązania wodorowe powstają między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów

86 Charakterystyka struktury - Struktura warstwowa, zbudowana z położonych obok siebie łańcuchów peptydowych Wiązania wodorowe powstają między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów W strukturze -cross wiązania wodorowe powstają zarówno między ugrupowaniami peptydowymi sąsiednich łańcuchów jak i w obrębie tego samego łańcucha

87 Struktura kolagenu

88 Charakterystyka struktury kolagenuJednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu

89 Charakterystyka struktury kolagenuJednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój

90 Charakterystyka struktury kolagenuJednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój Wiązania wodorowe występują tylko między łańcuchami polipeptydowymi w liczbie 1 mostek na 3 jednostki peptydowe

91 Charakterystyka struktury kolagenuJednostkę struktury stanowią trzy łańcuchy polipeptydowe o konformacji rozciągniętego lewoskrętnego heliksu Parametry pojedynczego heliksu: promień heliksu 0,1 nm; skok 0,251 nm przy 3 resztach aminokwasowych na zwój Wiązania wodorowe występują tylko między łańcuchami polipeptydowymi w liczbie 1 mostek na 3 jednostki peptydowe Małe heliksy skręcają się wokół wspólnej osi tworząc duży prawoskrętny heliks

92 Parametry konformacji helikalnych peptydówPierścień Heliks- prawoskrętny Heliks- prawoskrętny Płaska wstęga Heliks- lewoskrętny n – liczba reszt aminokwasowych na 1 zwój h(d) – translacja wzdłuż osi heliksu na 1 resztę aminokwasową p – odległość między sąsiednimi skrętami mierzona wzdłuż osi heliksu

93 Parametry konformacji peptydów – kąty rotacji wokół pojedyńczych wiązań - kąt rotacji wokół wiązania N - C   - kąt rotacji wokół wiązania C - C  - kąt rotacji wokół wiązania N – C  = 0  - kąt rotacji wokół wiązania N – C przyjmuje wartości  0º lub 180º W łańcuchu rozciągniętym zachodzi równość:  =  =  = 180º

94 Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana

95 Mapa konformacyjna wg. Ramachandrana c.d.