1 Bioinformatics – Functional Genomics – Dr. Víctor Treviño

2 [email protected]  MeV del sitio de TM4 (www.tm4.org)

3 [email protected]  GEO es una base de datos genérica en formato “standard” para almacenar y compartir datos de microarreglos  Como ejemplo vamos a buscar datos de Cáncer de Mama  Busque “Breast Cancer” en GEO  Filtre para “Homo Sapiens”  Seleccione Series  Agregue “Schmidt” en el query (deben aparecer 3)  Localice Schmidt-Gehrmann- Breast-GSE11121

4 [email protected] ARCHIVO/I D CONTENIDO GSM…Muestra GPL…Plataforma: Información del diseño del microarreglo GSE…Matriz de datos, Serie Original proporcionada por autores GDS…Data Set : Procesado por el NCBI, análisis básico ya hecho OtrosInformación adicional proporcionada por autores Descargue el Series Matrix File Algo de ayuda del archivo

5 [email protected]  Descomprima el GSE11121...gz  Abra en Excel el archivo GSE11121_series_matrix.tx t (texto, delimitado)  Comentatios con (!)  Serie  Samples  Datos normalizados por arreglo  Datos NO Normalizados entre arreglos  Cada columna es una muestra (GSM…)  Cada renglón es un gen

6 [email protected]  Abra MeV  Use File  Load Data  MeV puede leer archivos de diferentes formatos  El nuestro es de tipo Affymetrix pero obtenido desde GEO  Use Select File Loader  GEO Files  Use “Spotted” para que no cambie los datos.  MeV manual …  “In addition to being formatted correctly, the input data should already be normalized.”

7 [email protected]  Muestras en horizontal  Genes en Vertical  Color en la Intersección es el valor de intensidad  Cambio de colores (Scheme)  Y escalas (Scale)  Use valores cercanos al Lower, MidPoint y Upper

8 [email protected]  Siempre vea “Expression Image”  Realice la operación Log2 (si los datos no son ya logaritmicos)  Adjust  Log Trans..  Log2  Ahora nos falta normalizar entre arreglos usamos…  Adjust  Sample  Normalize Samples  Esto “Estandariza” los datos  v ij = (v ij – mean(v i )) / sd(v i )  Donde “i” es la muestra y “j” es el gen

9 [email protected]  Ajuste la visualización para que muestre  Verde = Valores de expresión “BAJOS”  Negro = Valores de expresión “Medios”  Rojo = Valores de Expresión “ALTOS”  Límites “Prácticos” menores que los extremos  Considere los valores de sus datos (encerrados en óvalos) +4.21 (máximo) Mínimo -4.31 0.05 50% datos (mediana) “Distribución” De los datos

10 [email protected]  Dado que leímos un GEO, las muestras no aparecen agrupadas en MeV, tenemos que indicar cuales son nuestros grupos de muestras para poder hacer operaciones estadísticas  Para agrupar muestras…  Use Cluster Manager  Sample Clusters  Use el botón Cluster by List Import  En el texto puede pegar las muestras que desee agrupar  Tiene que pegarlas EXACTAMENTE como aparecen en MeV (incluso comillas si estas aparecen)

11 [email protected]  Para hacer los grupos requiere de información clínica o relacionada a las muestras del experimento  Por ejemplo, puede guiarse del mismo archivo GSE… data matrix.txt y de los renglones “samples characteristics” 1. Copiar y pegar especial (transposed) muestras e información clínica y los nombres 2. Ordenar por carácterística (grade) 3. Agregar Comillas (usando la función concatenate) 1. =CONCATENATE("""",B2,"""") 4. Tomar los nombres de las muestras y ponerlos en el “Cluster Paste List” de Mev”, Use OK 5. Use Store Cluster y especifique el Nombre (Label) y Color del grupo 1 1 2 2 5 5 3 3 4 4

12 [email protected]  Statistics->T-test  Between Subjetcs  Para comparar un grupo vs otro  Variance Asumption  Usar Unequal variance  Para que sea mas “general”  P-Value Parameters  0.05 cuando se hace 1 prueba, saldrán 5% de falsos  Vamos a hacer + 20,000 pruebas t, tenemos que fijar el valor crítico mucho mas abajo  Usar 0.00005 = (1/20000) o incluso menor

13 [email protected] Información General Use t-Test  Expression Image  Significant Genes Se ve clara la diferencia? No están muy bien “ordenados” verdad? Se ve clara la diferencia? No están muy bien “ordenados” verdad?

14 [email protected] Establezca los genes significativos como la “fuente de datos activa” usando botón derecho y Set as Data Source (debe enmarcarse en verde indicando la activación) Use Clustering  Hierarchical Active las 2 casillas de “Tree Selection” : Gene Tree y Sample Tree Use Euclidean Distance Use “Average Linkage” (vea siguiente diapositiva para explicación) Active las 2 casillas de “Tree Selection” : Gene Tree y Sample Tree Use Euclidean Distance Use “Average Linkage” (vea siguiente diapositiva para explicación)

15 [email protected]  Clustering son métodos de agrupar objetos mediante la similitud de sus propiedades  Por ejemplo puedo agrupar autos en base a su color, forma, tamaño, desempeño o potencia  También los puedo agrupar considerando todas las carácterísticas al mismo tiempo  Para agrupar objetos por similitud, requerimos una función de “similitud” o en su caso, una función de distancia  Una medida de distancia tipica es la distancia euclideana Cual es la distancia entre los puntos A y B ? A B -2 +3 +1

16 [email protected]  Como podrías agrupar los objetos del A a la G ?  Que grupos se forman?  Claramente A+B+C vs F+G+E  Donde ponemos a D ? Junto A+B+C o junto F+G+E ?  Observa el cluster ABC, A y B están muy juntos, deberíamos separar a C ? A B -2 +3 +1 C D E F G

17 [email protected]  El método de agrupamiento jerárquico considera y resuelve las cuestiones observadas  Se basa en calcular una matriz de distancias  Luego agrupa todos los pares de muestras más cercanas (cuya distancia sea mínima)  Por ejemplo AB, luego FG  Luego va uniendo las sobrantes dependiendo de la distancia y el método de ligamiento (linkage)  Más cercano (single linkage)  Más lejano (complete linkage)  Promedio (average linkage)  Mas usado en genómica funcional  E se uniría a FG luego C a AB  Luego D a EFG y luego DEFG a ABC A B -2 +3 +1 C D E F G ABCDEFG

18 [email protected] ABCDEF B0.50 C1.411.12 D2.693.164.03 E4.274.745.022.92 F4.925.395.593.610.71 G4.595.035.153.580.750.56 XY A2.53 B33 C3.52 D04 E-1.51.5 F-21 G-1.50.75 Matriz de Distancias Datos Promedio = 1.265 Promedio = 3.3

19 [email protected]  En nuestro caso un objeto (A o B) podría ser la muestra o el gen.  Si el objeto es la muestra, tenemos 1223 genes dif. Exp., ¿como calculamos la distancia euclideana?  Donde X ij es la expresión del gen j en la muestra i o k  Luego se obtiene la matriz de distancias y luego el árbol jerárquico En 2 dimensiones, cual es la distancia entre los puntos A y B ? A B -2 +3 +1

20 [email protected]  Seleccione HCL(2)  HCL Tree Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 3 Grado 1 Grado 3 Grado 2 Grupo mayoritariamente Grado 1 Grupo mayoritariamente Grado 1 Clustering por Muestras Clustering Por Genes

21 [email protected] Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 1 Grupo mayoritariamente Grado 1 Genes expresados “BAJO” en Grupo 3 y “ALTO” en Grupo 1 Grado 1 Grado 3 Grado 2

22 [email protected] Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 1 Grupo mayoritariamente Grado 1 Genes expresados “ALTO” en Grupo 3 y “BAJO” en Grupo 1 Grado 1 Grado 3 Grado 2

23 [email protected] Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 3 Grupo mayoritariamente Grado 1 Grupo mayoritariamente Grado 1 Genes con poca diferencia podrían ser “falsos” Grado 1 Grado 3 Grado 2