1 BIOLOGIA KOMÓRKI http://www.uj.edu.pl/web/zbk/dydaktyka/kursy/wbt-165 Asystenci grup: dr hab. Jolanta Sroka pokój C121 (2.0.26) tel. 12 664 6143 [email protected] dr Monika Rak pokój C122 (2.0.27) tel. 12 664 6183 [email protected] Koordynator ćwiczeń: dr hab. Jolanta Sroka pokój C121 (2.0.26) tel. 12 664 61 43 [email protected]

2 Biologia komórki Ćwiczenia - zasady zaliczenia: uczestniczenie w zajęciach (dopuszczana 1 nieobecność usprawiedliwiona) przygotowywanie się na ćwiczenia (sprawdzanie wiadomości - oceny cząstkowe; ocen nie poprawia się) przygotowanie i wygłoszenie referatu (ocena z referatu to jedna z ocen cząstkowych) praktyczne zaliczenie ćwiczeń (musi być zaliczone na ocenę pozytywną) Charakterystyka kursu: 30 godzin wykładów 60 godzin ćwiczeń Prowadzący: wykłady: prof. dr hab. Zbigniew Madeja ćwiczenia: nauczyciele akademiccy ZBK doktoranci ZBK Podstawowe zasady BHP: - Zasady pracy w laboratorium o poziomie zagrożenia biologicznego BL- 1 - Zasady BHP w pracowni chemicznej Ocena końcowa z kursu będzie liczona jako: 20% oceny z ćwiczeń 80% oceny z egzaminu Ocenę z ćwiczeń wystawiamy obliczając średnią arytmetyczną: ocen otrzymanych przez studenta w trakcie całego semestru zajęć tj. „ocen cząstkowych” z poszczególnych ćwiczeń, oceny za referat seminaryjny oraz oceny z praktycznego zaliczenia ćwiczeń

3 Zalecana literatura: · M. Pluta – Mikroskopia optyczna rozdz. 8. Mikroskopia fazowo-kontrastowa. · L. Appel, R. Kowalczyk - Mikroskop. Budowa i użytkowanie. · B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część I, panel 1.1 · dostępny podręcznik fizyki doświadczalnej (dział – optyka- mikroskopy) · instrukcje dołączone do ćwiczenia Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń: - podstawowe pojęcia optyki, charakterystyka fali świetlnej; - budowa mikroskopu świetlnego jasnego pola - powiększenie, zdolność rozdzielcza mikroskopu, apertura numeryczna, - rodzaje mikroskopów świetlnych - budowa i zasada działania mikroskopu kontrastowo-fazowego MIKROSKOPIA W ŚWIETLE PRZECHODZĄCYM- BUDOWA I DZIAŁANIE MIKROSKOPU JASNEGO POLA, KONTRASTOWO-FAZOWEGO I Z KONTRASTEM NOMARSKIEGO Temat referatu: Mikroskopia świetlna (w świetle przechodzącym) – różnorodność technik, ich zalety i ograniczenia

4 PROPAGACJA LINII KOMÓRKOWYCH in vitro ZAKRES MATERIAŁU OBOWIĄZUJĄCY DO ĆWICZEŃ: 1. „Hodowla komórek i tkanek in vitro”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz II, str 49-63; 2. „Wzrost komórek”. CYTOFIZJOLOGIA pod redakcją K.Ostrowskiego i J.Kawiaka. 1990; rozdz X, str 345-65; 3. „Metody badań budowy i funkcji komórek”. SEMINARIA Z CYTOFIZJOLOGII pod redakcją J.Kawiaka i M.Zabla. 2002; rozdz 14, str 364-9; 4. „Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami”. PODSTAWY CYTOFIZJOLOGII pod redakcja J Kawiaka i wsp.. 1998. str. 488-504 5. OBSŁUGA KOMORY BUERKERA 6. „Mammalian Cell Culture. Methods. Dieter F. Huelser. 7. Materiały zawarte w instrukcjach do ćwiczeń. Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z podstawowymi procedurami związanymi z hodowlami prawidłowych i nowotworowych komórek in vitro Temat referatu: Metodyka hodowli zwierzęcych komórek prawidłowych i nowotworowych

5 WYKORZYSTANIE HODOWLI KOMÓRKOWYCH W TRANSPLANTOLOGII Ćwiczenie seminaryjne mające na celu zapoznanie się z zasadami funkcjonowania laboratorium dedykowanego prowadzeniu hodowli komórek wykorzystywanych klinicznie oraz z wynikami prac nad wykorzystaniem komórek skóry ludzkiej w leczeniu ran. ZALECANA LITERATURA Drukała J., Sporniak-Tutak K. (2002). Wykorzystanie współczesnych osiągnięć inżynierii tkankowej w gojeniu ran powłok. (Application of tissue engineering in wound healing) Przegląd Lekarski,59: 862-866. Drukała J., Majka M., Ratajczak M.Z. (2003) Postępy w metodach izolacji i namnażania komórek macierzystych naskórka. Postępy Biologii Komórki,30 (Supl.21):37-48. Temat referatu: Choroby skóry związane z nieprawidłowością organizacji cytoszkieletu komórkowego.

6 MIKROSKOPIA FLUORESCENCYJNA – 1 Przyżyciowe barwienia organelli wewnątrzkomórkowych ER mitochondria endosomy Temat referatu: Mikroskopia fluorescencyjna w badaniach struktury i funkcji komórek Hoechst DiOC6 Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się: - z budową i działaniem mikroskopu fluorescencyjnego - wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych do wizualizacji organelli w żywych komórkach Zakres materiału, jaki należy przygotować do ćwiczeń: - Budowa i zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego - Zastosowanie fluorescencji w biologii komórki i diagnostyce klinicznej - Budowa i funkcje podstawowych organelli wewnątrzkomórkowych komórki ssaka - Metody wizualizacji w komórce poszczególnych organelli Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005, część druga, rozdział 15 M. Pluta: Mikroskopia optyczna. Mikroskopia fluorescencyjna, rozdział 9 str. 473-517 red. B Alberts et al. - Molecular biology of the cell, 2009 (V), rozdział 12. T. Pollard i W. Earnshaw – Cell biology, 2nd ed., 2008, rozdziały 19-22

7 MIKROSKOPIA FLUORESCENCYJNA – 2 CYTOSZKIELET Barwienie filamentów aktynowych Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: - Aktyny i białka wiążące aktynę - Organizacja i funkcje cytoszkieletu aktynowego w mięśniach i komórkach niemięśniowych. - Rola małych białek G w regulacji funkcji cytoszkieletu aktynowego -Białka motoryczne związane z filamentami aktynowymi -Funkcje cytoszkieletu aktynowego w komórkach niemięśniowych -Mechanizm skurczu mięśni prążkowanych Zalecana literatura:  B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdział 17  red. R Makuch i M. Rędowicz: Cytoszkielet; Kosmos, 2001, t.50, nr 3, str. 283-295  red. H. Strzelecka-Gołaszewska: Motory molekularne, Kosmos, 2001, t.50, nr 4, str. 349-358; 375-390  red. B Alberts et al. - Molecular biology of the cell, 2009 (V), rozdział 16.  T. Pollard i W. Earnshaw – Cell biology, 2nd ed., 2008, rozdziały 33 i 36 Temat referatu: Organizacja cytoszkieletu aktynowego w komórkach niemięśniowych ( z uwzględnieniem roli białek Rho w regulacji cytoszkieletu) Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z metodą wizualizacji cytoszkieletu aktynowego w komórkach zwierzęcych www.canisius.edu/biology/cell_imaging/gallery.asp

8 TESTY WITALNOŚCI KOMÓREK Ćwiczenie ma na celu praktyczne zapoznanie się z podstawowymi testami witalności wykorzystywanymi na co dzień w pracy laboratoryjnej. ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA 1. Transport przez błonę komórkową. 2. Testy witalności – rodzaje, zastosowanie, ograniczenia. 3. Barwniki stosowane do wizualizacji struktur w komórkach żywych i utrwalonych. ZALECANA LITERATURA: 1. Instrukcja do ćwiczeń. 2. Seminaria z cytofizjologii Pod redakcją Jerzego Kawiaka i Macieja Zabla (rozdz.4 i 6). 3. Podstawy cytofizjologii, Praca zbiorowa pod Redakcją J.Kawiaka, J.Mireckiej, M.Olszewskiej, J.Warchoła (rozdz.2 str 58-90 i rozdz.4 358-376) Temat referatu: Rodzaje śmierci komórek i metody ich detekcji.

9 BANKOWANIE KOMÓREK W OPARACH CIEKŁEGO AZOTU Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z techniką programowanego bankowania komórek w oparach ciekłego azotu. Ćwiczenie polega na przygotowaniu komórek do zamrożenia i przeprowadzeniu mrożenia programowanego. ZALECANA LITERATURA Methods in Molecular Biology, vol. 368: Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols, Second Edition. Edited by: J.G. Day and G.N. Stacey © Humana Press Inc., Totowa, NJ – rozdziały 3, 16,19. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am.J.Physiol. 247, 1984 Lillford P.J., Holt C.B. In vitro uses of biological cryoprotectants. Phil.Trans.R.Soc.Lond. B(2002) 357,945–951

10 MECHANIZMY RUCHÓW KOMÓRKOWYCH – wpływ anestetyków na komórki. Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń : 1. Aktywność ruchowa komórek niemięśniowych. 2. Cytoszkielet aktynowy i mikrotubularny- rola w migracji komórek; rola małych białek G w regulacji cytoszkieletu i migracji. 3. Udział jonów wapnia w migracji komórek. 4. Mechanizm działania anestetyków. Zalecana literatura: Podstawy Biologii Komórki. Wprowadzenie do Biologii Molekularnej. Alberts i wsp. Postępy Biochemii 2009 Tom 55 Numer 2: a) "Sposoby migracji komórek nowotworowych" Popow-Woźniak A., NowakD., Malicka-Błaszkiewicz M. b) "Regulacja migracji komórek przez jony wapnia" Pomorski P. Amoeba proteus, by Wim van Egmond lidokaina Ćwiczenie ma na celu zapoznanie się z mechanizmami ruchu komórek, obserwację wpływu etanolu i jonów wapnia na ruchliwość ameb oraz poznanie metod rejestracji ruchu ssaczych komórek tkankowych. Temat referatu: Strategie ruchów komórek w układach trójwymiarowych.

11 ANALIZA AKTYWNOŚCI ENDOCYTARNEJ KOMÓREK ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: · Przebieg procesu endocytozy – drogi transportu pęcherzykowego w komórce (szlaki endocytarne; przedziały endosomalne) · Różne mechanizmy endocytozy (fagocytoza, makropinocytoza, endocytoza przez pęcherzyki otoczone klatryną, endocytoza przez kaweole) · Znaczenie procesu endocytozy dla komórki zwierzęcej i organizmu ZALECANA LITERATURA: · B. Alberts i inni.- „Podstawy Biologii Komórki”, red. H. Kmity i P. Wojtaszka, PWN 2005; Rozdz.15. · B. Alberts et al. – Molecular Biology of the cell. – 4th. Ed. Garland Science 2002, part IV/13. · T. Pollard. - Cell Biology - Wydawca: W.B. Saunders Company, 2007; chapter: 22. · Strukturalne podstawy biologii komórki „Transport pęcherzykowy” – W. Kilarski, Warszawa 2003; rozdział: 5.1. · D. Cichoń, M. Michalik. Wnikanie wirusów do komórek na drodze endocytozy – mechanizmy i wybrane aspekty kliniczne. Mikrobiologia Medycyna 4: 16-26, 2004. Ćwiczenie ma na celu: Obserwację (w mikroskopie kontrastowo-fazowym) zjawiska pinocytozy zachodzącej w komórkach zwierzęcych oraz sprawdzenie czy aktywność pinocytozy zależy od czynników zewnętrznych i stanu metabolicznego komórki (skład jonowy pożywki, pH, temperatura). Temat referatu: Znaczenie endocytozy dla komórek i organizmów.

12 NIEZALEŻNY OD KONTAKTU Z PODŁOŻEM WZROST KOMÓREK NOWOTWOROWYCH ZAGADNIENIA DO PRZYGOTOWANIA: Molekularne podstawy transformacji nowotworowej i tworzenia przerzutów. Hodowle komórek in vitro. Oddziaływanie komórek z podłożem i sąsiednimi komórkami, wzrost komórek na podłożach stałych i półpłynnych. ZALECANA LITERATURA: B. Alberts. Podstawy biologii komórki. PWN 2005. rozdz. 21. J. Kawiak i in. Podstawy cytofizjologii. PWN 1995, rozdz. 29. B. Alberts. Molecular Biology of the cell. Garland Science 2002, rozdz. 23. Większość komórek nowotworowych hodowanych in vitro, w przeciwieństwie do komórek prawidłowych, nie wykazuje zależności wzrostu od przyczepienia do podłoża. Celem ćwiczenia jest założenie półpłynnej hodowli komórek szczurzego mięsaka XC, a następnie obserwacja powstałych kolonii. Temat referatu: Mechanizmy transformacji nowotworowej.

13 ZASTOSOWANIE WIROWANIA W GRADIENCIE GĘSTOŚCI DO SEPARACJI KOMÓREK SSACZYCH Ćwiczenie ma na celu: -Przegląd obecnie panujących poglądów na temat heterogenności komórek i wynikających z niej potrzeb separacji wybranych populacji. -Zapoznanie się z podstawowymi zastosowaniami liczników cząstek (na przykładzie licznika Coulter Z2) do określania liczebności oraz rozkładu wielkości komórek w danej populacji. - Zapoznanie się z podstawowymi technikami separacji komórek zwierzęcych oraz próba rozdzielenia komórek różniących się gęstością wypornościową Temat referatu: Metody separacji komórek Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1.Zasady separacji komórek 2.Podstawowe techniki separacji komórek 3.Sposoby weryfikacji czystości otrzymanych frakcji. Zalecana literatura: 1. P.C. Turner, A.G. Mc Leeman, A.D. Bates, M.R.H. White Krótkie wykłady- Biologia Molekularna (Sekcja A2- izolacjia organelli) 2. Alberts, Podstawy Biologii Komórki od str 17 (jedność i różnorodność komórek)/ str 32-33 (panel)/ 160-161- (panel- rozbicie komórek i frakcjonowanie)

14 TECHNIKI GENEROWANIA HETEROKARIONTÓW Ćwiczenie ma na celu obserwację zjawiska fuzji, przyczepionych do podłoża komórek szczurzego mięsaka XC, wywołanej działaniem glikolu polietylenowego (PEG) Zakres materiału obowiązujący do ćwiczeń: Budowa błony komórkowej. Fuzja błon a fuzja komórek. Zjawisko fuzji komórek w procesach fizjologicznych. Metody fuzji komórek in vitro, warunki niezbędne do fuzji. Teorie tłumaczące proces fuzji błon komórkowych, białka fuzyjne. Praktyczne wykorzystanie zjawiska fuzji – komórki mieszańcowych w badaniach naukowych, zastosowanie przeciwciał monoklonalnych. Zalecana literatura: B. Alberts i in.: Podstawy biologii komórki, PWN 2005; część II, rozdz. 11(str. 365-388), rozdz. 15 (str. 512-516). J. Kawiak, M. Zabel: Seminaria z cytofizjologii, Wrocław 2002; rozdz. 6 (str. 127-141). Praca zbiorowa po redakcją J. Kawiaka: „Podstawy cytofizjologii” Warszawa 1998; część II (str. 58-78). Praca zbiorowa pod redakcją J. Kawiaka i K. Ostrowskiego: Cytofizjologia, 1990; rozdz.2 (str. 56-58), rozdz. 13 (str. 406-408). Temat referatu: Praktyczne zastosowania fuzji komórek.

15 WIZUALIZACJA MIĘDZYKOMÓRKOWEGO TRANSFERU FLUOROCHROMÓW Złącza szczelinowe zbudowane są z kompleksów białkowych tworzących międzykomórkowe kanały, które łączą przedziały cytoplazmatyczne sąsiednich komórek. Kanały złącz zbudowane są z dwóch koneksonów, heksamerów białek z rodziny koneksyn Cel ćwiczenia: Zapoznanie się z prosta techniką wizualizacji komunikacji międzykomórkowej za pośrednictwem złącz szczelinowych. Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń: 1. Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego. 2. Test żywotności komórek z wykorzystaniem dwuoctanu fluoresceiny. Zalecana literatura: 1. Instrukcje do ćwiczeń 2. Alberts, Biologia komórki Temat referatu: Funkcje złącz szczelinowych w organizmach wielokomórkowych.

16 ĆWICZENIA ZALICZENIOWE SAMODZIELNE WYKONANIE DWÓCH Z PONIŻSZYCH ZADAŃ: - Ustawienie oświetlenia Kohlera w mikroskopie i przygotowanie mikroskopu jasnego pola do pracy w trybie kontrastu faz; - Przeprowadzenie testu witalności komórek; - Oznaczenie gęstości komórek w zawiesinie; - Wykonanie pasażu komórek.

17 Uwaga: „Zakres materiału, który należy przygotować do ćwiczeń” oraz „Zalecana literatura” mogą zostać uaktualnione przez asystenta prowadzącego dane ćwiczenie. Informacje na ten temat zostaną zamieszczone na tablicy dla studentów (obok wejścia do Sali ćwiczeń ZBK) oraz na stronie www kursu Biologia komórki, najpóźniej tydzień przed planowanymi zajęciami. Proszę sprawdzać komunikaty.