1 Biología Molecular en Endocrinología Gustavo F. Gonzales Septiembre 2005

2 Biología Molecular  Es el estudio de la biología a un nivel molecular. Su campo se superpone con otras áreas de la biología, particularmente la genética y la bioquímica. biologíamolecular biologíagenética bioquímicabiologíamolecular biologíagenética bioquímica  Se refiere al entendimiento de las interacciones entre los varios sistemas de una célula, incluyendo la interrelación del DNA, RNA y la síntesis de proteínas y aprender como se regulan estas interacciones.

3 Biología Molecular  Es el estudio científico de la base molecular del proceso de la vida, incluyendo la respiración molecular, excreción y reproduccción.  El término Biología Molecular fue acuñado en 1938 por Warren Weaver, quien sería luego director del programa de Ciencias Naturales en la Fundación Rockefeller.  En 1950 W. T. Astbury de la Universidad de Leeds usó el término en su acepción actualmente aceptada: Para describir el área de investigación, muy cercanamente relacionada y a menudo superponiéndose a la Bioquímica, conducido por biólogos cuyo abordaje e interés en la biología están principalmente en el nivel molecular de organización.

4 Genoma humano  1953: Watson y Crik decriben la estructura de doble hélice del DNA  Junio del 2000: Borrador del genoma  30,000-40,000 genes  500,000- 1millón de proteínas

5 Expression cloning  Una de las técnicas más básicas de la biología molecular para estudiar la función de las proteínas es expression cloning.  En esta técnica, el DNA que codifica para un a proiteína de interés es clonado (usando PCR y/o enzimas de restrictión) en plásmidos (conocidos como vectores de expresión). clonadoPCRenzimas de restrictiónplásmidosclonadoPCRenzimas de restrictiónplásmidos  Este plásmido puede tener elementos promotores especiales que facilitarán la producción de la proteína de interés.  Este plásmido puede ser insertado en células bacterianas o en células animales. La inoculación de DNA en las células bacterianas se denomina transformación transformación

6 PLASMIDOS  Aunque en general es adecuado decir que el genoma de los procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen, además, uno o varios elementos genéticos accesorios extracromosómicos, a los que denominamos plásmidos.

7 The polymerase chain reaction (PCR) polymerase chain reactionpolymerase chain reaction  Es una técnica extremadamente versátil para copiar DNA.  PCR permite que una secuencia simple de DNA sea copiada (millones de veces), o alterada de manera predeterminada. Por ejemplo, PCR puede ser usada para introducir sitiops de restricción en enzimas, o para mutar (cambiar) bases particulares de DNA. PCR puede ser usado para determinar si un fragmento particular de DNA se encuentra en la cDNA library. cDNA librarycDNA library

8 Estudio de las Funciones  Extirpación de órganos: Siglo XIX, Mitad de Siglo XX  Extirpación de Genes: Fines de Siglo XX, Siglo XXI

9 El ratón Knockout  A mouse missing a single gene (that has been knocked out). Knockout mice are used in biomedical research.  A mouse in which a single gene of choice is inactivated or "knocked-out" in a manner that leaves all other genes unaffected.

10 ¿Cómo se prepara un gen Knock Out?  The gene to be "knocked out" is first isolated and genetically engineered to that it is inactive and carries genetic "tags" within it.  The gene to be "knocked out" is first isolated and genetically engineered to that it is inactive and carries genetic "tags" within it.  This genetic construct is then introduced into special cells called embryonic stem cells. In a small number of cases, the inactivated gene will align with the correct gene, and then replace it. This event can be traced by the genetic tags introduced into the defective gene.  This genetic construct is then introduced into special cells called embryonic stem cells. In a small number of cases, the inactivated gene will align with the correct gene, and then replace it. This event can be traced by the genetic tags introduced into the defective gene.  Those embryonic stem cells carrying the inactivated gene can then be isolated and introduced (by injection) into a pre-embryonic structure called the blastocyst.  Those embryonic stem cells carrying the inactivated gene can then be isolated and introduced (by injection) into a pre-embryonic structure called the blastocyst.  The blastocyst can then be transplanted into a female mouse to develop to term. Some of the cells in the resultant mouse will contain the inactivated gene.

11 Homocigotes Knock out  El blastocisto conteniendo el defecto en el gen es transplatado a una ratona hembra.  El blastocisto conteniendo el defecto en el gen es transplatado a una ratona hembra.  Algunas de las células de los ratones resultantes (crías) contienen al gen inactivado.  El apareo de un macho y una hembra cada uno conteniendo el gen inactivado produce un ratón o ratona homocigote.

12 Pakareinen T, Zhang FP, Nurmi L, Poutanen M, Huhtaniemi I: Knock out of luteinizing hormone receptor abolishes the effects of follicle stimulating hormone on pre-ovulatory maturation and ovulation of mouse Graafian follicles. Mol Endocrinology 2005. June  La expresión del receptor de LH es esencial, además de participar en la ovulación, para la maduración folicular en la progresión del estadío antral al pre- ovulatorio.

13 APOPTOSIS  Muerte Celular Programada  Marcadores: Caspasa 3

14 Apoptosis

15 Northen Blot y Western Blot  Evaluación del RNA  Evaluación de anticuerpos anti-proteínas

16 Biología Molecular en Endocrinología  Ejemplos en la Literatura

17 Mantamadiotis T, Krets O, Ridder S, Bleckmann SC, Bock D, Grone HJ, Malaterre J, Dworkin S, Ramsay RG, Schutz G. Mol. Endocrinol. 2005. Sep  Hypothalamic CREB loss causes anterior pituitary hypoplasia and dwarfism in mice

18 Pascual-Le Tallec L, Lombes M. Mol Endocrinol 2005. 19:2211-2221  The mineralocorticoid receptor: a journey exploring its diversity and specificity of atcion.

19 Makridakis NM, Reichardt JK. J. Urol 2004; 171: S25-28  Molecular epidemiology of androgen- metabolic loci in prostate cancer: predisposition and progression

20 Gonzales GF, Chung FA, Miranda S, Valdez LB, Zaobornyj T, Bustamante J, Boveris A. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 288:H2568-2573  Heart mitochondrial nitric oxide synthase is up-regulated in male rats exposed to high altitude (4,340 m)

21 Moeller LC, Dumitrescu AM, Refetoff S. Mol Endocrinol 2005. Jul  Cytosolic action of thyroid hormone leads to induction of HIF-a (alpha) and glycolitic genes.

22 Tabb MM, Blumberg B. Mol Endocrinol 2005; Jul 21.  New modes of action for endocrine disrupting chemicals

23 Chang CL, Roh J, Park JL, Klein C, Cushman N, Haberberger RV, Hsu SY. Mol. Endocrinol 2005, Jul  Intermedin (IMD) functions as a pituitary paracrine factor regulating prolactin release.