1 BIOLOGÍA MOLECULAR Erase una vez…Dr. GERARDO DANIEL DELUCA Laboratorio de Aplicaciones Moleculares Facultad de Medicina-UNNE

2 Los primeros pasos … PCR ADN Electroforesis QUENCHER ARRAYS ARN RFLP Hibridación Secuenciación DOT BLOT NASBA Clonación HIBRIDACIÓN REVERSA

3 El gran ninguneado de la microbiología se toma revancha…Molar mMolar - uMolar L /mL/uL uLitro Grs/mgrs nGrs / fGrs. Moles mMoles /nMoles

4 Dogma central de la biología molecularDNA  RNA  PROTEINAS F. Crick

5 El código genético

6 Principales descubrimientos y avances de la era molecular1960  Kromberg aisló y purificó la ADN polimerasa  Doty et al descubren las propiedades de hibridación del DNA. 1962  Arber aisla y purifica las enzimas de restricción. 1967  Se descubre la ADN ligasa 1972  Boyer Cohen y Berg desarrollan las técnicas de clonación 1975  Southern desarrolla la hibridación del ADN con sondas específicas 1977  Métodos de secuenciación de ADN (Sanger y Gilbert) 1981  Primeros animales transgénicos 1985  Invención de la PCR (Kary Mullis) 1997  Secuenciación de genomas bacterianos completos 2001  Secuenciación del Genoma Humano

7 Aplicaciones de la Biología Molecular¿Cuál será la influencia probable de la biología molecular sobre el porvenir de la medicina? Los virus y las enfermedades virales Desórdenes metabólicos hereditarios Malformaciones adquiridas, congénitas y estructurales Cáncer Edward L. Tatum, Atomes 1968 Biotecnología (industria, animales, vegetales, microorganismos) Clonación de órganos y animales Medicina humana y veterinaria (diagnóstico y terapia génica) Medicina Personalizada Identificación de personas  huella genética Paleontología

8 PRINCIPALES APLICACIONES DE LA PCRINVESTIGACIONES PALEONTOLÓGICAS Y DE FÓSILES INVESTIGACIONES FORENSES MEDICINA HUMANA

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10 PCR: REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

11 Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos) TIPOS DE PCR CONVENCIONAL PCR común Nested PCR Nested PCR (1º round primers genéricos y 2º round primers específicos) Heminested PCR PCR de baja astringencia (RAPD PCR) RT-PCR

12 AMPLIFICACIÓN Más ampliamente utilizadaPCR Más ampliamente utilizada Distintos formatos caseros y comerciales NASBA Comercial Cargas virales y monitoreo bDNA

13 MANUALES AUTOMATIZADOSEXTRACCIÓN DE ADN O ARN MANUALES Con solventes Sin solventes AUTOMATIZADOS Robotizados Magnéticos y de vacío

14 Hibridación con sondas marcadasDETECCIÓN Electroforesis Hibridación con sondas marcadas LIPA Fluorescencia RLB ELISA

15 Metodología utilizada:HC V Metodología utilizada: RT-PCR anidada de la región 5´no codificante (5´NC) del genoma viral combinada con el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)  100pb  ACRILAMIDA / Nitrato plata 251pb AGAROSA / BrEt

16 HPV PCR-RFLP PCR  Ez de restricción GENOTIPO RFLP 

17 Micobacterias PCR-RFLP

18 RT-PCR MÚLTIPLE VIRUS RESPIRATORIOS

19 HIBRIDACIÓN REVERSA RLB

20 Inno-Lipa Micobacterias

21 Curva de amplificación PCR

22 Detección objetiva del amplicón Menor tamaño ampliconesReal time PCR Ventajas No se hace corrida Detección objetiva del amplicón Más sensible Multiplex Más rápida Menor tamaño amplicones Cargas virales

23 Real time PCR

24 Curva de melting

25 Curva de melting

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29 TaqMan probes

30 Molecular beacon probes

31 DIAGNÓSTICO MOLECULARDETECCIÓN MÉTODO DE AMPLIFICACIÓN EXTRACCIÓN DE ADN O ARN

32 Amplificación isotérmicaEj: Bayer Quantiplex – NASBA (HIV – HCV) Lectura por electroquimioluminiscencia

33 Branched DNA Quantiplex bDNA Signal Amplification System, de Chiron Corporation (VIH – VHC –VHB)

34 Hibridación de captura HPV – Chlamydia trachomatis – Neisseria

35 Secuenciación

36 Ej. aplicaciones en infectología: Determinación de resistencia de la transcriptasa reversa y proteasa a antivirales en pacientes HIV+; resistencia a ganciclovir en CMV y resistencia a rifampicina en Mycobacterium tuberculosis.

37 DNA CHIP MICROARREGLOS DE DNA

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