1 BOLILLA 1 ENZIMAS: Naturaleza Química- Propiedades Generales- Nomenclatura y Clasificacion- Coenzimas y Grupos Prostéticos. Actividad Enzimática: Unidad de enzima- Actividad específica- Actividad molecular. Complejo ES- Ecuación de Michaelis Menten y Ecuación de Lineweaver Burk- Significado e importancia de Km y Kcatalítica- Inhibición competitiva y no Competitiva. Factores que afectan la actividad enzimatica: [Enzima]- pH – T- [S] Regulación Enzimática: Enzimas alostéricas (propiedades y cinética)- Zimógenos- Modulación Covalente Isoenzimas: Propiedades e importancia.

2 ENZIMAS Transformación de nutrientes simples en moléculas complejas y viceversa Extracción de energía desde combustibles por oxidación Polimerización de subunidades para formar macromoléculas, etc

3 CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMASPROTEINAS y RNA (Ribozimas): Estructura terciaria y cuaternaria SITIO DE UNION AL SUSTRATO: Uniones no Covalentes (puente de hidrógeno, hidrofóbicas, electrostáticas NECESITAN DE FACTORES ENZIMATICOS: Inorgánicos (metales) y orgánicos (Coenzimas) ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO: Estereoespecificidad y especificidad geométrica SON REGULABLES: La síntesis de la proteína, su actividad y degradación.

4 DISTRIBUCION DE LAS ENZIMASCOMPARTIMENTALIZACION: Diferentes localización dentro de la célula. SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta distintos sitios catalíticos

5 USOS DE ENZIMAS EN BIOTECNOLOGIAMutagénesis Dirigida: - Estudiar mecanismos enzimáticos - Cambiar especificidades enzimáticas - Aumento de tolerancia a condiciones extremas. Enzimas híbridas. Proteinas de fusión Ej. Activ.de glucanasas y celulasas microbiana, Activ.Nucleasa estafilococica

6 Tipos de reacciones catalizadas por enzimasOxido-reducción Rotura y formación de enlaces C-C Reorganizaciones internas Transferencia de grupos Reacciones de condensación

7 Cómo se clasifican las enzimas???Clase subclase subsubclase nº de orden Lactato deshidrogenasa 1-OXIDORREDUCTASAS Alcohol deshidrogenasa (EC ) 2. TRANSFERASAS Hexoquinasa (EC )

8 3. HIDROLASAS 4. LIASAS 5. ISOMERASAS 6. LIGASAS Carboxipeptidasa A(EC ) 4. LIASAS Piruvato descarboxilasa (EC ) 5. ISOMERASAS Fumarasa ó malato isomerasa (EC ) 6. LIGASAS Piruvato carboxilasa (EC )

9 VITAMINAS-COENZIMAS Niacina NAD, NADP Ion Hidruro (:H -) PDH GADRiboflavina (Vit.B2) FAD, FMN Electrones SDH Tiamina (Vit. B1) PP-tiamina Aldehídos PDH, TC Acido pantoténico Coenzima A Grupos acilo Tiolasa Acido fólico TH4 Grupos monocarbonados Ser-Treon. Deshidrat. Piridoxina (B6) P-piridoxal Transferencia grupos aminos GPT AAC-DESC Acido lipoico Lipoamida Electrones y grupos acilos. PDH

10 Ejemplos de Enzimas que requieren iones metálicos como cofactoresFe++ ó Fe+++ Citocromo oxidasa Catalasa Peroxidasa Zn++ Anhidrasa carbónica Hexoquinasa Glucosa-6-fosfatasa Piruvato quinasa Mg++ K+ Piruvato quinasa

11 mmol de S transformados mmol de S transformados/minACTIVIDAD ENZIMATICA Unidades Internacionales Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 umol de S por minuto Actividad Específica Actividad enzimática por cada miligramo de proteína presente en la muestra Actividad Molecular ó Numero de Recambio Moléculas de S convertibles en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima U.I.E. = mmol de S transformados min 1 katal = 6 x 107 U.I.E. Actividad específica = U.I.E. mgr de proteína Actividad molecular = Mol de enzima mmol de S transformados/min

12 ACTIVIDAD ESPECIFICA A B + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ + Prot.Tot: ∑ Despecífica U.I.E. mgr de proteína = Activ. Enzimática Prot. totales Prot.Tot: ∑

13 Como funcionan las enzimas??Modelo llave-cerradura Sitio activo Modelo inducido Sitio activo Estado de transición (ES)

14 Ejemplo: REACCION CATALIZADA POR LA HEXOQUINASAD-Glucosa

15 Factores que afectan la actividad enzimáticaConcentración de Sustrato Concentración de Enzima pH Temperatura

16 EFECTO DE LA CONCENTRACION DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD INICIALVelocidad inicial (vo) [S]

17 Efecto de la concentración de enzima sobre la actividadConcentración saturante de sustrato, pH y temp. constantes

18 Influencia del pH sobre la actividad enzimática

19 Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimo

20 Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimáticaactividad por de la temperatura T(ºC) Actividad enzimática T. óptima de temperatura provoca desnaturalización

21 ISOENZIMAS Diferentes formas moleculares de una misma enzima.Son sintetizadas por genes diferentes Tienen diferente composición aminoacídica por lo que pueden separarse por electroforesis. Catalizan la misma reacción, actuando sobre el mismo sustrato para dar el mismo producto

22 Dos isoenzimas presentan en generaldiferentes valores de Km y Vmáx. Se encuentran ubicadas en diferentes compartimentos de la célula ó en diferentes tejidos. Son utilizadas en clínica para determinar el origen del tejido dañado

23 Lactato deshidrogenasa (LDH)Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido. H4 H3M H2M2 HM3 M4 M > Músculo H > Corazón

24 Ejemplo de isoenzima: Glucoquinasa y hexoquinasaActividad enzimática Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l

25 Energía de activación de una Reacción catalizada y una reacción no catalizadaREACCION NO CATALIZADA REACCION CATALIZADA

26 Diagrama de coordenadas de una reacción enzimática catalizada y sin catalizarP (*) DG* cat ∆G* reacción no catalizada S Energía Libre (G) Estado de transición Progreso de la reacción ES EP

27 Relación entre velocidad y concentración de sustratoE + S ES E P k1 k2 k-1 [E]t = [E] + [ES] v o= k2[ES] Concentración saturante de sustrato [S] >>> [E] Medida de velocidad inicial Paso limitante: Descomposición de ES

28 ESTADO ESTACIONARIO E + S ES E + Pk1 k2 k-1 V. de Formación de ES = k1 ( [Et ] –[ ES ] ) [S] V. de Descomp.de ES = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] ESTADO ESTACIONARIO k1 ( [Et ] – [ ES ] ) [S] = k-1 [ ES ] + k2 [ ES ] v o= k2[ES] Km = (k-1 + k2)/k1 Vmáx = k2 [Et]

29 Representación de la ecuación de Michaelis - MentenVo [S]

30 Km se considera una medida de la afinidad de la enzima por el sustratoSIGNIFICADO DE Km E + S ES E P k1 k2 k-1 Km = (k-1 + k2)/k1 k2<<< k-1 Km = k-1 /k1 Km =Ks Km se considera una medida de la afinidad de la enzima por el sustrato

31 Constante de velocidad del paso limitanteSIGNIFICADO DE Vmáx E + S ES E P k1 k2 k-1 E + S ES EP k2 k1 k3 P k-1 k-2 [Et] = [E] + [ES] Vmáx = k2 [Et] No siempre el paso limitante de la velocidad está dado por k2 Constante de velocidad del paso limitante Vmáx = k3 [Et] kcat Vmáx = kcat [Et] Número de recambio (t-1)

32 Eficiencia catalítica de una enzima                                    Eficiencia catalítica de una enzima Vmáx = kcat [Et] CUANDO [S] <<<< Km La velocidad depende de la concentración de enzima total y de la concentración de sustrato kcat/Km es una constante de velocidad y es el mejor parámetro para conocer la eficiencia catalítica de una enzima

33 GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA O DE LINEWEAVER-BURKOrdenada al origen = 1/Vmáx. Pendiente= Km/Vmáx Intersección c/eje x = - 1/Km

34 INHIBICION ENZIMATICACOMPETITIVA NO COMPETITIVA ACOMPETITIVA INHIBICION REVERSIBLE POR ENLACE COVALENTE (Análogos del estado de transición) INHIBIDOR SUICIDA DIFP Quimotripsina INHIBICION IRREVERSIBLE Penicilina Transpeptidasa Alopurinol Xantina oxidasa

35 INHIBICION REVERSIBLEINHIBICION COMPETITIVA E E + S ES E + P I EI I + [E] [I] [EI] Ki = S     KM ap = Km(1 + [I]/Ki)

36 Ejemplo de Inhibidor competitivoSuccinato + FADH Fumarato + FAD+ Succinato deshidrogenasa COO- (CH2)2 COO- CH2 Succinato Malonato

37 v Gráfica de M-M Km Km ap [S] 1/v Gráfica de L-B 1/[S] -1/Km -1/Kmap

38 INHIBICION NO COMPETITIVAS E + S ES E + P + I EI + I ESI I E S I + S

39 Km [S] v Gráfica de M-M -1/Km 1/[S] 1/v Gráfica de L-B Vmáx ap.= Vmax.s/I      Km(1 + [I]/Ki)

40 INHIBICION ACOMPETITIVAE + S ES E + P + I ESI E S E S I

41 Inhibición acompetitiva1/[S] 1/ Vmáx C/ Inhibidor S/ Inhibidor 1/Vmax. Inh. 1/Vmax. s/Inh. -1/Km c/inh -1/Km s/inh

42 Características de los diferentes tipos de inhibición reversibleTipo de El Inhibidor Efecto Efecto inhibición se une a s/Vmáx s/Km Competitiva E Ninguno Aumenta No competitiva E y ES Disminuye Ninguno Acompetitiva ES Disminuye Disminuye Kma c/I. = Km s/Inh. (1+ [I]/Ki) Vmáx c/I= Vmáx. s/Inh. / 1 + [I]/ Ki

43 Acción de inhibidores a distinta concentraciónCOMPETITIVA NO COMPETITIVA Pendiente = Km / Vmáx

44 INHIBICION IRREVERSIBLE. Por unión covalente del inhibidor - Acetilcolinesterasa - Quimotripsina Enzima inactivada Diisopropilfluorfosfato (DFP)

45 INHIBICION IRREVERSIBLE. Inhibidor suicida Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima. El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas). Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

46 REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMASREGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS ENZIMAS ALOSTERICAS REGULACION POR PROTEINAS REGULACION POR PROTEOLISIS REGULACION COVALENTE ENZIMAS INDUCIBLES REGULACION DE LA SINTESIS DE LAS ENZIMAS

47 MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOSENZIMAS ALOSTERICAS Enzima 1 2 3 4 Enzima 1 ENZIMA ALOSTERICA MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

48 Bifurcación de una vía metabolica

49 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICASPoseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio alostérico) La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente. Son homotrópicas o heterotrópicas. En general poseen dos o mas sitios reguladores. La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades. En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo

50 CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICA Curva Sigmoidea

51 Regulación de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa (ATCasa)Aspartato (mM)

52 EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICASHexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa Vía glicolítica AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato deshidrogenasas Ciclo de Krebs

53 ASPARTATO TRANSCARBAMILASA (ATCasa) Dominio carbamil fosfatoDominio aspartato Dominio Zinc Dominio alostérico Dominio carbamil fosfato

54 REGULACION POR MODIFICACION COVALENTEEnzima Enzima Enzima Enzima Fosforilacion Fosfoadenilacion Enzima Enzima ADP-Ribosilación

55 Ejemplo de regulación covalenteFosforilasa fosfatasa 2 Pi 2 H2O Fosforilasa quinasa ATP ADP Fosforilasa b P -O-CH2 CH2- O- P Fosforilasa a (menos activa) (Cadena lateral de Ser) CH2- HO HO-CH2

56 REGULACION POR PROTEOLISISPor eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa. Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina. Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea. ZIMOGENOS

57 REGULACION POR PROTEINASModifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa. RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrógenos con las bases del DNA