1 Canto Rodríguez YuselineMulti-desarrollo-HPTLC Método para la cuantificación de la hiosciamina, escopolamina y sus precursores biosintéticos en seleccionadas plantas solanáceas cultivadas en condiciones naturales y como cultivos in vitro Equipo: Aguilar Magaña Diana Canto Rodríguez Yuseline Pérez Muñoz Sharon
2 Tropano alcaloides Son importantes productos farmacéuticos obtenidos a partir de plantas solanáceas, principalmente de Atropa, Datura, Hyoscyamus y especies Duboisia Debido a su actividad anticolinérgica son ampliamente utilizados en medicina como antiespasmódicos en la reducción de la tensión de los músculos lisos digestivo y de las vías urinarias Intentos de síntesis química han resultado económicamente inviable debido a su estereoquímica Se han intentado desarrollar métodos para producir tropano alcaloides en plantas en cultivos in vitro, independientemente de la temporada y las condiciones climáticas Como midriáticos en el examen oftalmoscópico y para prevenir la enfermedad del movimiento
3 El objetivo de esta investigación fue desarrollar las condiciones para el TLC, separación y cuantificación de hiosciamina , escopolamina, Littorine, anisodamina y cuscohigrina encontrado en los extractos de las plantas intactas y/ o in-vitro biomasas deHyoscyamus niger, Atropa baetica , Atropa belladona y Datura stramonium. No hay informes en la literatura acerca de la separación por TLC de anisodamina y Littorine , importantes precursores en la biosíntesis de tropano alcaloides. Se han realizado investigaciones sin embargo la mayoría de ellas se refieren sólo a los compuestos que son importantes por uso medicinal , es decir, hiosciamina y escopolamina o su degradación ( tropina, ácido trópico o apoatropine)
4 Productos químicos y normas experimentalesDisolventes y reactivos fueron de analítica grado, comprado a Poch. La hiosciamina se obtuvo de Extrasynthese, escopolamina de Sigma- Aldrich y anisodamina de laboratorios LKT Littorine y cuscohigrina fueron aisladas de raíces peludas Atropa Bética Se aplicaron extractos de la concentración, de la planta (400 ml) en placas de sílice PLC y se desarrollo dos veces con cloroformo: metanol: acetona: 25 % de amoniaco y corrió a distancias de 10,0 y 7,5 cm respectivamente Antes de cada desarrollo se preacondicionaron las placas con los vapores de fase móvil para 5 min en un paso gemela cámara cromatográfica Dos bandas principales se obtuvieron de 20 placas y el gel de sílice se eluyó tres veces con metanol: 25 % de amoniaco Los extractos combinados de cada banda se evaporaron a sequedad, produciendo cuscohigrina y Littorine Las estructuras se confirmaron mediante correlación de enlace multiple heteronuclear, la coherencia cuántica de un solo heteronucleo y correlación de espectroscopia y se comparo los datos con los valores de la literatura apropiados. Espectros de una y dos dimensiones de RMN de muestras se registraron a 500 y 125 MHz, respectivamente, utilizando un espectrómetro Varian Unity Plus
5 Material vegetal Platas intactas deHyoscyamus niger L. , Datura strammonium L. y Atropa belladonna L. se obtuvieron del Jardín de Plantas Medicinales de la Universidad Médica de Gdansk, Polonia Los análisis cromatográficos se realizaron sobre extractos de alcaloides obtenidos de las hojas y raíces de H. niger , D. y A. strammonium belladona crecido en condiciones naturales. Las muestras seleccionadas de plantas solanáceas in vitro también fueron examinados para el contenido de alcaloides: 1. Microtallos de H. niger cultivado en sólido de Murashige y Skoog suplementado con 3,4 mg /L de 6- bencilaminopurina 2. Microtallos de Atropa baetica cultivadas en medio sólido MS suplementado con 3,4 mg /L de BAP 3. Raíces adventicias de H. niger cultivaron en MS líquido suplementado con 1.0 mg /L de indol- 3- butírico 4. Raíces peludas del H. niger cultivado en medio líquido MS sin fitohormonas 5. Raíces peludas de Atropa baetica se cultivaron en medio MS líquido sin fitohormonas
6 Preparación de la muestraLa muestra se liofilizó y finamente se molió (en un mortero) se sometieron a ultrasonidos las muestras del suelo de biomasa vegetal (aprox. 100 mg) en temperatura ambiente, 3 X 15 min) en tubos de ensayo de polipropileno con un disolvente de extracción de cloroformo: metanol: 25% de amoníaco (15:15:01, v / v / v) (20 mL). Después de la filtración y la evaporación de los disolventes a presión reducida a 40 °C, el residuo se repartió entre cloroformo (10 mL) y 0,5M H2SO4 (10 mL). La capa ácida se hizo alcalina con 25% de amoníaco (pH = 9,0) y se extrajo con cloroformo (3 X 20 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se evaporaron bajo presión reducida a 40 °C. La liofilización es la remoción de agua de las células congeladas (sólidas) a presión reducida (sublimación). Para llevar a cabo este procedimiento, se toma una muestra del cultivo por conservar y se suspende en algún medio con crioprotectores como leche, suero o glutamato de sodio.
7 Los residuos se reconstituyeron en metanol (1 mL) y se almacenó a 4 °C hasta el análisis.Para el medio líquido (todo volumen recogido después de 30 días de cultivo aprox. 15 mL) se hizo alcalina (pH = 9,0) con 25% de amoníaco y luego se extrajo con cloroformo (320 mL). Las capas orgánicas recogidas se secaron sobre sulfato de sodio anhídro y se evaporaron a presión reducida (40 °C). Las muestras se reconstituyeron en metanol (1 mL) y se almacenaron a 4 °C hasta el análisis.
8 Cromatografía La cromatografía planar se realizó en 5cm X 20 cm Si60 F 254 TLC y placas de HPTLC de Merck. Las fases móviles dedicadas para alcaloides tropano TLC separación de la literatura se utilizaron en los experimentos preliminares. Los estándares de alcaloides primarios, como soluciones metanólico (1 mg / mL), de tanto aislada y comerciales compuestos se diluyeron hasta una concentración final: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 y 3 mg/10mL. Todas las muestras y estándares se aplicaron manualmente a la placas por medio de una jeringa Hamilton TLC (Reno, NV, EE.UU.) como 5 mm.Las bandas y el volumen de aplicación fue de 10 a 30 mL para las muestras y 10 mL para los estándares. Para el análisis cualitativo y cuantitativo, todas las muestras y los estándares fueron separados en placas de HPTLC (5 CMA 20 cm Si60 F 254, Merck, Darmstadt, Alemania) con una fase móvil que consiste en cloroformo: metanol: acetona: 25% amoníaco (75:15:10:1.6).
9 Primera etapa Segunda etapaEn la primera etapa (placa preacondicionamiento) de la primera etapa de desarrollo, la fase móvil (aprox. 25 mL) se vertió en una cubeta de la cámara de TLC y la placa cromatográfica con las muestras cargadas se puso en el segundo, comedero seco y acondicionado durante 5 min. Después de la fase de preacondicionamiento procedimiento, por la inclinación de la cámara, la fase móvil (aprox. 10 mL) se transfirió a la artesa seco en el que se colocó la placa y fue desarrollada a una distancia de 4 cm y se secó (5 min, en una corriente tibia de aire). Segunda etapa En la segunda etapa de desarrollo el procedimiento de preacondicionamiento fue repetido y luego la placa de cromatografía fue desarrollada a una distancia de 3 cm. Después de la segunda etapa de desarrollo, las placas se secaron durante 5 min en una corriente de aire caliente se escanearon en λ = 190 nm para análisis de anisodamina utilizando un densitómetro (Desaga CD60). Las placas de TLC cargadas se desarrollaron utilizando una de dos etapas multi-desarrollo (MD) , con cada etapa que comprende dos pasos. Munier y Macheboeuf (Baerheim-Svendsen y Verpoorte, 1983). Los otros compuestos fueron examinados en λ = 520 nm después de la pulverización y derivatización con Reactivo de Dragendorff siguiendo una modificación. Los cromatogramas fueron documentados fotográficamente. Las exploraciones lineales se obtuvieron con hendidura dimensiones de 0,02 mm X 10 mm.
10 Validación del método Las curvas de calibración (área de pico frente importe por carril) para hiosciamina, Littorine, cuscohigrina y escopolamina fueron lineales en el rango de ng / carril, y para anisodamina en el intervalo de ng / carril. Los límites de detección (LD) y cuantificación (LOQ) para los análisis de HPTLC se calcularon a partir de una ecuación de calibración ya que los importes por los que la relación señal-ruido (S / N) fueron ≥ 3:01 y ≥ 10:01, respectivamente, con el uso de una muestra en blanco. Ellos son expresado como la cantidad (ng) de alcaloide examinado por carril. Se midieron la precisión del instrumento (repetibilidad) y la precisión intermedia, se calcularon utilizando zonas de puntos medidos para 2000 ng de anisodamina, cuscohigrina, hiosciamina, escopolamina y Littorine por carril. Para la medición de la repetibilidad, la misma muestra fue analizada de forma independiente seis veces en cada placa HPTLC. La precisión Intermedio se midió mediante un análisis de seis muestras, preparado con la mismo procedimiento de preparación de muestras y se analizaron en las mismas condiciones cromatográficas (en la misma placa) en un solo día (precisión intradía) y en tres días diferentes (entre días de precisión) Para la recuperación se midió para las soluciones patrón añadido, en tres concentraciones, a 100 mg de A. Bética raíces peludas de conocida composición. Después, la muestra se extrajo de acuerdo con el procedimiento descrito.
11 Medición de contenido El contenido de alcaloides de una muestra de la planta se informó como la media de los tres extractos independientes de que la muestra y expreso como mg / g de material vegetal seco. Cada extracto se cargó y se analizó por triplicado en la misma placa. Para cada medición, curvas de calibración de anisodamina, hiosciamina, escopolamina, Littorine y cuscohigrina se construyeron de forma independiente, utilizando seis diferentes patrones de calibración.
12 Resultados y discusionesHay un potencial de efectos adversos relacionados con la matriz en el logro de separación cromatográfica de los analitos a partir de biomasa de la planta. Por lo tanto, el trabajo de desarrollo en la separación de hiociaminaa y la escopolamina, sus respectivos precurors Littorine y anisodamina, y el producto de una ruta biosintética paralela cuscohigrina ), se llevó a cabo usando el extracto alcaloide de Atropa Bética raíces peludas que previamente se ha demostrado que produce una fracción alcaloide compleja. Después muchas iteraciones en la concentración de constituyentes de la fase móvil (Amoniaco, metanol, acetona, cloroformo) el mejor método de análisis implicó el uso de placas de HPTLC Si60 desarrollados con cloroformo: metanol: acetona: 25% de amoniaco (75:15:10:1.8 v / v / v / v). La fracción alcaloide de A. baetica raíces peludas se separó con 12 componentes de reaccionar con el reactivo de Dragendorff. Después co-cromatografía con los estándares, cinco de los alcaloides fueron identificados como anisodamina, cuscohigrina, hiosciamina, Littorine y escopolamina respectivamente.
13 La separación de los alcaloides fue suficiente para los análisis cualitativos. Sin embargo, los ensayos de densitométricos revelaron que la evaluación cuantitativa de Littorine y escopolamina todavía no era viable debido a la mala intensidad de las bandas que representan a estos alcaloides. Para evitar esto y para mejorar la separación de alcaloide, se utilizó la técnica de multi-desarrollo. Esta estrategia proporciona la mejor separación de anisodamina, cuscohigrina, hiosciamina, Littorine y escopolamina, con factores de resolución en la mayoría de los casos mayor que 1 (Rs> 1). Para proporcionar una mejor reproducibilidad de las separaciones se empleó la cámara de doble canal Camag. Los dos canales separados en el dispositivo permitir tanto la saturación simultánea de la cámara con los vapores de la fase móvil, y el precondicionamiento de las placas cromatográficas.
14 El procedimiento de desarrollo se puede iniciar sin necesidad de abrir la cámara, simplemente inclinándolo, de ésta manera, el ambiente de saturación apropiada se puede mantener Sin embargo, anisodamina y cuscohigrina, incluso después de que el procedimiento de desarrollo y preacondicionamiento, aun tenían valores de Rf muy similares. Por lo tanto, con el fin de determinar el contenido de anisodamina, era necesario aplicar grandes cantidades de extractos de plantas sobre la placa cromatográfica. Se realizó un barrido densitométrico con UV (L=190nm) sin rociar con el reactivo de Dragendorff. Dada la ausencia de grupos cromóforos en la estructura de cuscohigrina, el análisis cuantitativo de anisodamina podía llevarse a cabo bajo éstas condiciones. Los parámetros validados fueron precisión, repetibilidad y la recuperación de las condiciones de separación. Por lo tanto las condiciones desarrolladas fueron utilizadas en los análisis cuantitativos de diversas matrices analíticas , incluyendo plantas de biomasa, cultivos in vitro, campo de cultivo y medios de cultivo recogidos después de la cosecha de los cultivos in vitro. La selección de matrices de análisis hizo posible evaluar la utilidad de las condiciones desarrolladas para los análisis de TLC- proyección de anisodamina, cuscohigrina, hiosciamina, escopolamina littorine y en los materiales vegetales de diferentes fuentes.
15 La anisodamina se detectó en la mayoría de las muestras de plantas, pero sólo en pequeñas cantidades, con la mayor concentración registrada en las raíces adventicias H. niger. La Hyoscyaamine estaa presente en todas las muestras analizadas, a excepción de los dos microtallos Hniger y hojas de plantas intactas. Las cantidades más altas de éste se registraron dentro del cuadro –grown A. Las cantidades más altas de la escopolamina estuvieron presentes en INH. Raíces nigerhairy de cultivos in vitro, que era 5 veces mayor que las cantidades registradas en las raíces de planta intacta. La demanda de escopolamina es mayor que para otros alcaliodes de tropano y para uso médico. Los alcaloides de tropano en la mayoría de las plantas solanáceas son producidos en las raíces, y las partes aéreas son sólo un lugar para la acumulación de producto final.
16 Este hecho, puede explicar menores cantidades de alcaliodes de tropano y la falta de sus precursores en las hojas de las plantas intactas ensayados en los experimentos en comparación con las matrices de raíz. La ausencia de alcaloides en microtallos niger H. que no mostraron la formación de raíces también fue causado por el metaolismo organoespecifico de alcaloides tropano. Las altas cantidades de alcaloides particularmente en medios de crecimiento que se colectaron después del cultivo in vitro de las biomasas sugiere enfoques alternativos y mayor facilidad de obtención de los alcaloides de sistema de cultivo. Los resultados obtenidos sugieren que condiciones MD-HPTLC se pueden utilizar con éxito para el cribado de ensayos de hiosciamina, escopolamina y sus precursores en diversos materiaes de plantas, incluyendo cultivos in vitro, el crecimiento de medios de comunicación y las plantas cultivadas en el campo.
17 REFERENCIAS Jaremicz, Z., Luczkiewicz, M., Kisiel, M., Zárate, R., Jaber-Vazdekis, N., Migas, P. Multi- development-HPTLC Method for Quantitation of Hyoscyamine, Scopolamine and their Biosynthetic Precursors in Selected Solanaceae Plants Grown in Natural Conditions and as In Vitro Cultures. Phytochemical Analysis. 2013