1 Cap 10 – Análisis de Genes y Genomas JA Cardé, PhD Universidad Adventista Alberts et al.

2 Objetivos Al finalizar la presentación el estudiante podrá: – Definir biotecnología – Conocer los mecanismos de corte y unión del DNA por enzimas – Conocer métodos de visualización de las moléculas orgánicas. – Establecer diferencias, parecidos la importancia y los diferentes tipos de vectores y bibliotecas – Conocer distintas aplicaciones de la biotecnología

3 Biotechnology 3 greeks roots -Bios - life -Teuchos - tools -Logos - study -Study of tools from living things

4 Biotechnology “ The application of science and technology to living organisms, as well as parts, products and models thereof, to alter living or non-living materials for the production of knowledge, goods and services. ”

5 Biotechnology Biotechnology means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make or modify products or processes for specific use. ” - Wikipedia.org

6 Biotechnology -Using living organisms, their products or derivatives as tools to solve human issues to improve our life quality. - Organisms: Model systems - Products: Proteins, Antibiotics, Genetically Modified Products (GMPs) - Issues: health, environmental, economical

7 ¿Qué es biotecnología? Es el uso de organismos vivos, o sus productos para mejorar nuestra calidad de vida y/o nuestro ambiente. Dependiente grandemente de avances en: – Biología molecular – Métodos y/o Tecnología de DNA recombinante

8 10_04_Restrict.nuclease.jpg Enzimas de Restricción Palíndromes 5’ GTAATC 3’ 3’ CTAATG 5’ Cohesivos Romos Nomenclatura Aplicaciones M a n I p u l a c I ó n del DNA

9 10_05_gel.electrophor.jpg Analisis y Visualización de DNA Azul Met EtBR-UV Radioactividad

10 Como se verá la gel? EcoRI 5GA / ATTC5 3CTTA / AG3 Alu I 5AG / CT 3 3TC / GA5 Not I 5GC / GGCCGC3 3CGCCGG / CG5 LAS 3 A LA VEZ?!!! 5’AAGAATTCGCGGAATTCGAGCTTAAGGGCCGCGCGCCGAAGCTTTAAA3 ’ 3’ TTCTTAACGCCTTAAGCTCGAATTCCCGGCGCGCGGCTTCGAAATTT 5’

11 10_11_BAC.clones.jpg Mapas de Restricción Clonos de BAC Varias enzimas - individuales y en conjunto Solapamientos

12 10_12_de_renaturation.jpg Denaturación y Renaturación DNA - DS - Complementaridad - GC / AT 3 enlaces vs 2 enlaces; TM Complejidad del Genoma – Experimentos Cot Secuencias altamente repetitivas Moderadamente Repetitivas Unicas

13 10_14_1_Southrn.blotting.jpg Southern/Northern Blotting

14 10_14_2_Southrn.blotting.jpg Visualización

15 10_18_ DNA.in.vitro.jpg Moléculas Quiméricas Ligación = Clonación Cortes Ligación y/o Complementaridad

16 10_19_DNA.uptake.jpgTra Transformación Bacteriana – Griffith Competencia Transformacion 2

17 10_20_Bacteria.plasmid.jpg Plasmidos Bacterianos Vectores Ori Antibiótico MCS/Polylinker ORF Ejemplos: pAMP pKAN pBLUE

18 10_21_DNA ligase.jpg Digestión/Digestión Cloning Ligación Quimera Transformación Cultivo/Resistencia

19 10_22_cloned.DNA.frag.jpg Transformación – Selección - Replicación – DNA Miniprep Transformacion 1

20 10_23_genomic.library.jpg Bibliotecas: Genómica -Restricción -Ligación -Clonación -Replicación -Selección

21 10_24_hybridization.jpg Screening - Replica plating - Probing radioactivo - Autoradiografía

22 10_25_cDNA.jpg Bibliotecas: de cDNA mRNA Total Oligo dT RT RNAsa H DDDP - replicación DS DNA copia mRNA Clonar  Selección  Screen.

23 10_26_Genomic_cDNA.jpg vs

24 10_27_1_PCR_amplify.jpg Reacción de la Polimerasa en Cadena: PCR -Objetivo -aplicaciones

25 10_27_2_PCR_amplify.jpg PCR 1PCR 1, PCR 2PCR 2

26 10_28_PCR_clones.jpg Aplicación-cloning

27 10_29_PCR_viral.jpg Aplicación – detección/diagnóstico

28 10_30_1_PCR_forensic.jpg Aplicación - Forense - VNTR

29 10_30_2_PCR_forensic.jpg

30 10_07_1_enzym.dideoxy.jpg Secuenciacion Di-deoxi Aplicación - Secuenciación

31 10_07_2_enzym.dideoxy.jpg 4 reacciones ddNTPs PCR PAGE Autoradiografia

32 10_08_DNA.sequencing.jpg Secuencia Digitalizada/Color Code PCR / Fluorescencia http:www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

33 10_31_SerialDNA.clone.jpg Clonación en secuencia Para unir un grupo de fragmentos derivados de distintos origenes

34 10_32_expressionvector.jpg Vectores de Expresión -Ori, Antibiotico, Polylink -Promotor eficiente -Senales de poliA etc -Transformado en celulas

35 10_33_gene_protein.jpg Dogma Central Repensado - huevo o gallina/gen o proteína?

36 10_34_Reporter.genes.jpg cual será el efecto de seq 1 sobre seq 3) Genes Reporteros -Determinar el patron de expresion de un gen -Quiero saber cual celua expresa a X, proteina indetectable

37 10_35_GFP.jpg GFP: Gen Reportero Promotor de neurona con GFP Neuronas expresando GFP

38 Hibridización In situ -Detección de la presencia de papiloma humano -Sonda pink complementaria al genoma viral

39 10_16_In.situ.hybrdztn.jpg In situ En cromosomas Localizar genes Cromosoma 5 2 pts/por cada gen, WHY?

40 10_13_hybridization.jpg Diagnósticos Diagnóstico Screening poblacional para Sckl cell anemia

41 10_15_DNA.microarrays.jpg cDDNs de dos celulas para comparar expresion Marcarlos fluorescente(rojo/verde) Mezclar e hibridizar con el array Lavados, Rastreos, Lectura 110 genes Rojo A > B o Verde B>A o Amarillos Análisis: spot Rojo, este gen es del pool R, donde se expresa mas que en el otro pool, lo mismo para verde DNA Microarray - Para monitorear la expresión de miles de genes a la vez ER Rx ER No Rx

42 10_36_mutagenesis.jpg Site Directed Mutagenesis

43 10_37_engineered.org.jpg Sustituciones: mutantes, KO, doble copia

44 10_38_ES.cells.jpg Transgénicos

45 10_39_Transgenic.mice.jpg

46 10_40_Transgenic.plant.jpg Transgénicos

47 ¿Preguntas?