1 Cátedra de Toxicología y Química Legal, UNLPLa Plata, 7 de Junio de 2007 1ra Jornada SINDROME UREMICO HEMOLITICO “TRATAMIENTOS NO TERMICOS DE INACTIVACION DE SEROTIPOS DE Escherichia coli RELACIONADOS CON EL SUH EN ALIMENTOS LIQUIDOS” Dra. LEDA GIANNUZZI Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA), UNLP-CONICET. Cátedra de Toxicología y Química Legal, UNLP

2 Las frutas se encuentran expuestas a la contaminación microbiana tanto en su cosecha, como en su transporte y comercialización. En los jugos, el riesgo de contaminación con bacterias patógenas como las E. coli productoras de toxina shiga (STEC) es elevado, debido principalmente a: 1) La capacidad de muchos serotipos, de sobrevivir en alimentos de bajo pH y 2) La elevada prevalencia de varios serotipos en alimentos, en el mundo y en Argentina. Los serotipos de E.coli productores de toxina shiga (STEC), asociados a enfermedades en humanos se denominan E.coli enterohemorrágicos (EHEC). Escherichia coli O157:H7 es el prototipo de un grupo de más de 100 serotipos (O26:H11; O103:H2; O111:NM; O121:H19; O145:NM; entre otros) que comparten el mismo potencial patogénico. EHEC: Asociado con Síndrome Urémico Hemolítico (SUH).

3 Durante la reunión realizada en octubre de 2006, el Grupo de Trabajo de Criterios Microbiológicos de la CONAL discutió respecto a la probable incorporación de las STEC del serotipo no-O157 al CAA, alcanzando las siguientes conclusiones: Argentina presenta una incidencia elevada de SUH. En el año 2005, la tasa de notificación fue de 13,9 casos/ niños menores de 5 años, la más alta del mundo. Cepas STEC no-O157 se detectan en aproximadamente el 25% de los casos de SUH en el país. Cepas STEC no-O157 son detectadas en reservorios animales y en alimentos, representando el 95% y 60%, respectivamente, del total de las cepas STEC detectadas. Algunos serotipos de STEC no-O157 detectados en alimentos fueron asociados a SUH en Argentina y en otras partes del mundo. Por lo tanto, es importante la inclusión de STEC no-O157 a los criterios microbiológicos de productos cárnicos del CAA a los efectos asegurar la calidad microbiológica de los alimentos destinados a la población, previniendo el SUH. Fuente:

4 La principal vía de transmisión de STEC O157 y no-O157 son los alimentos contaminados.La contaminación de los alimentos se debe principalmente al contacto con las heces del ganado bovino. Aunque... Se demostró que el 50,8% de los rumiantes silvestres del Jardín Zoológico y Botánico de La Plata portaban STEC, incluyendo el aislamiento de STEC O146:H28 (asociado con enfermedad en humanos) de un roedor autóctono, lo que sugiere que estos podrían ser portadores y eventuales transmisores de este patógeno. (Leotta y col, Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in captive non-domestic mammals. Veterinary Microbiology Vol 118(1-2): ) Otras formas de transmisión incluyen el contacto directo del hombre con los animales, la contaminación cruzada durante la preparación de alimentos, y la transmisión persona a persona por la ruta fecal-oral.

5 Como llegan las STEC a las frutas ?????

6 Según el Codex: JUGO DE FRUTALíquido sin fermentar, pero fermentable, que se obtiene de frutas en buen estado, debidamente maduras y frescas o frutas que se han mantenido en buen estado por procedimientos adecuados La industria comercial de jugos se inicia en 1869 con el embotellado de jugo de uva por la compañía Welch de (N.J.) Esta industria introdujo el principio de conservación mediante pasteurización, lo que permite elaborar productos de larga vida útil Efecto destructivo sobre enzimas y la posibilidad de generar cambios en el valor nutricional, así como en las propiedades sensoriales

7 Los jugos de fruta no pasteurizados, son seguros???pH ácido... Es suficiente ??

8 E.coli enterotoxigénica Salmonella enteritidisAño Patógeno involucrado Vehiculo de contaminación Nº de casos localidad País Cita 1923 Salmonella Typhi Sidra de manzana 24 --- EE.UU Parish, 2000 1944 Jugo de naranja 18 Ohio Parish, 1997 1974 300 Nueva Yersey Anonymous, 2000 1980 E.coli O157:H7 14 Ontario Canada 1991 23 Massachussets Besser y col; 1993 1992 E.coli enterotoxigénica (O138) 6 India Singh y col, 2000 1993 Cryptosporidium spp 213 Maine 1995 Salmonella Hartford 63 21 estados Smith, 1999 1996 Jugo de manzana (Odwala) 70 4 estados Clarke, 1996 Connecticut CDC, 1997 Washington Farber, 2000 1998 Tamblyn y col, 1999 1999 Salmonella Typhimurium 500 Adelaida Australia Parish y col, 2000 Salmonella muenchen 15 estados EE.UU, Canadá 5 Oklahoma 2000 Salmonella enteritidis Jugos de naranja y limonada 7 estados Harris, 2003 Jugos de fruta sin pasteurizar pueden presentarse como un potencial vehículo de transmisión de STEC

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10 Entrada de los animales a zonas frutales + * 1996: Washington, California, Colorado: 70 afectados. Consumo de jugo de manzana no pasteurizado. Causas: * Recolección de manzanas caídas a la tierra contaminada con heces de ciervos. Entrada de los animales a zonas frutales + Contaminación de manzanas caídas + Lavado insuficiente de manzanas Extracción y envasado del jugo Consumo de jugo no pasteurizado Supervivencia de E. coli a pH bajo = Infección

11 Tecnologías no térmicas de conservación de alimentos

12 + Seguridad microbiológica !!!Surgen en el contexto donde los consumidores valoran características de los alimentos que les confieren mayor valor añadido como son: Una escasa manipulación La conservación de características sensoriales y nutricionales propias del alimento fresco + Seguridad microbiológica !!!

13 En el 2002, la FDA propone la implementación de un plan de HACCP para la producción de jugos y derivados. Dentro de dicho plan, sugiere la aplicación de tratamientos alternativos a la pasteurización capaces de lograr reducciones de 5 ciclos logarítmicos. HACCP

14 Altas Presiones

15 Fundamento: Sometimiento del producto a una elevada presión hidrostática ( MPa ó – atm), desde minutos hasta algunas horas Fluido transmisor: agua Ventajas: Transmisión isostática y casi instantánea de la presión a todos los puntos del alimento Destrucción de microorganismos Inactivación enzimática Mantenimiento de vitaminas, aromas y sabor Producto entero Puede modificar la textura y/o funcionalidad del alimento Limitaciones: Alto costo Limitaciones con algunos envases

16 El alimento se somete a presiones uniformes entre 2000 y 9000 atm.Donde encontramos estas presiones? 1 Pascal = 1 N/m2 1 Pa = 10-5 bar 1 bar = atm = kg/cm2

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18 El estudio de los efectos de las altas presiones sobre diversos sistemas data del siglo XIX. El alto costo y las dificultades técnicas de su aplicación industrial impidieron que se empleara en la práctica, en especial en el área de alimentos. 600 kg/h

19 * 1 cepa de E.coli O157:H7 * N0= UFC/ml * Buffer fosfato (PBS, 1M, pH= 7) y jugo de naranja (pH = 3.8) * Presiones de entre MPa durante 20minutos a TºC ambiente

20 3 5 1 a 3 1 5 b Reducción (Log) de E.coli O157:H7 ATCC inoculada en: a) PBS (pH 7); b) Jugo de naranja (pH 3.8), tratada con 1, 3 o 5 pases de 200 MPa. No= 106 UFC/ml; TºC 20ºC Completa inactivación: PBS= 3 y 5 pasajes. Jugo de naranja= 5 pasajes Control 200 MPa , 1 pasaje 200 MPa , 5 pasajes Completa ruptura celular Pérdida citoplasmática Poros en la membrana celular Parcial deformación y ruptura celular

21 * 3 cepas de E.coli O157:H7 * N0= UFC/ml. * Inoculadas en caldo y en leche descremada * Presiones de entre MPa durante 20minutos a TºC ambiente

22  Mayor inactivación en caldo que en leche Reducciones de hasta 7 log en caldo y hasta en leche.  Efecto protector de la leche sobre las bacterias

23 Campos eléctricos pulsados

24 Tratamiento a baja temperatura Posibilidad de trabajo en continuo Fundamento: Aplicación de pulsos eléctricos de microsegundos de alta intensidad de campo eléctrico (104 V) en alimentos colocados entre dos electrodos. El equipo incluye un generador de alto voltaje, una cámara de tratamiento, un sistema de refrigeración y un equipo de envasado aséptico, además de los sistemas de control. Ventajas: Tratamiento a baja temperatura Destrucción microbiana Posibilidad de trabajo en continuo Alta eficiencia energética Limitaciones: Alimentos viscosos y homogéneos de tamaño de partícula pequeño (<1cm) Desconocimiento de efectos sobre algunos alimentos

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26 N0= 107-108 UFC/ml. Medio de Recuperación= PCA

27 Daño provocado por PEF

28 Radiación Gamma

29 Fundamento: Radiaciones gamma (procedente de cobalto 60). Dosis varían entre 0,075 y 10 kGy según producto. (Directivas 1999/2/CE y 1999/3/CE) Ventajas: Aumento de la temperatura inapreciable No hay pérdidas de nutrientes Destrucción microbiana e inactivación enzimática No deja residuos No se modifican los constituyentes Alta penetración en envases. Tratamiento de palets. Limitaciones: Mala imagen Costo elevado Poco efectivo en líquidos Instalaciones propias

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31 la utilización de irradiación?“La irradiación es el proceso más estudiado en la historia de la humanidad para asegurar la sanidad de los alimentos” Quién apoya y aprueba la utilización de irradiación? Organización Mundial por la Salud (OMS) Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y Agricultura (FAO) Codex Alimentarius Administración de Drogas y Alimentos (US Food & Drug Administration---FDA) Departmento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) American Medical Association (Asociación Americana de Médicos) American Dietetic Association Academia Americana de Pediatría Cámara Americana en Ciencias y Salud (American Council on Science & Health)

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33 * 3 cepas de E.coli O157:H7 * N0= UFC/ml. * Cepas adaptadas y no adaptadas previamente a las condiciones ácidas * Inoculadas en 6 lotes de jugo de manzana (diferente absortividad y pH) * Dosis de entre 0-2 KGy. * Temperatura de tratamiento= 2ºC

34 Resistencia a la radiación gamma es cepa dependienteAcido-adaptadas Acido-adaptación de E.coli O157:H7 aumenta la resistencia a la radiación gamma en jugo de manzana. No Acido-adaptadas Resistencia a la radiación gamma es cepa dependiente

35 Resistencia de O157:H7 varía según las características del jugoRelación entre los valores D y la absorbancia de los jugos

36 Radiación Ultravioleta

37 Fundamento: Radiaciones no ionizantes. Fuente: Lámparas de mercurio de alta y baja presión Ventajas: Aumento de la temperatura inapreciable Bajo costo Poca pérdida de nutrientes Destrucción microbiana No deja residuos Efectivo en alimentos líquidos, principalmente aguas Limitaciones: Poca penetrabilidad Poca inactivación enzimática

38 (Formación de dímeros de T-T, C-C, C-T y U-U; “Región germicida” (Formación de dímeros de T-T, C-C, C-T y U-U; Cambios en las proteínas) Espectro electromagnético

39 Radiación ultravioleta =Es efectiva para inactivar cepas STEC en jugos de fruta ???

40 Dosis = Intensidad x Tiempo de exposiciónConcepto de DOSIS Dosis = Intensidad x Tiempo de exposición Joule/cm2 Minutos Cantidad de Energía por unidad de área en mW/cm2

41 Dosis (E) de UV se determinan con un Radiómetro digital (VLX-3X CE)4 Lámparas de baja presión de mercurio (Lux 30W/G30 T8, Phillips) H1= 40cm H2= 15cm Agitador orbital Sistema de ventilación Dosis (E) de UV se determinan con un Radiómetro digital (VLX-3X CE)

42 Radiómetro digital (VLX-3X CE)Visor Digital Célula Fotoeléctica Radiómetro digital (VLX-3X CE)

43 Cual es la supervivencia de cepas STEC en jugo de naranja exprimido ??

44 Todas las cepas son toxigénicas. = O157:H7 EDL 933; ■= O157:H7 33/98;Resistencia de cepas de E. coli en jugo de naranja es un fenómeno cepa dependiente. Todas las cepas son toxigénicas. = O157:H7 EDL 933; ■= O157:H7 33/98; ▲= O157:H7 303/00; ▼= O157:H7 547/03; = O157:H7 749/03; = O103:H2; ■= O113:H21; ▲= O145:NM; ▼= O26:H11; = ATCC Medio de cultivo para el crecimiento de sobrevivientes: Agar Triptona Soja (TSA). Cepas cedidas por la Dra. Marta Rivas. Servicio Fisiopatogenia, Departamento Bacteriología INEI - ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

45 Cuales son los factores que influyen en la efectividad del tratamiento con UV en la inactivación de E. coli en alimentos líquidos ??

46 Condiciones estudiadasAlimentos líquidos con diferente coeficiente de absortividad (turbidez) Cepas utilizadas: O157:H7 EDL 933 y ATCC 25922 Dosis (E, J/cm2) = Intensidad (I, mW/cm2) x tiempo de exposición (t, seg) Efecto de la I y de la E en la inactivación por UV de E.coli (E= 0 y 8; I= 3.3 y 4.8) Efecto del inóculo inicial (N0= 106 UFC/ml y 104 UFC/ml) Efecto del espesor de la película expuesta al UV (0.7mm y 2.8mm) Efecto de la agitación del sistema (0 y 220 rpm) Efecto del medio de cultivo empleado para el recuento de sobrevivientes (TSA y SMAC) Alimentos líquidos pH Absortividad (cm-1) r2 Jugo de Manzana Esterilizado 3.53 (0.02) 0.071 (0.02) 0.997 Jugo de Naranja Esterilizado 3.47 (0.01) 0.352 (0.08) 0.998 Jugo Multifrutas Esterilizado 3.76 (0.05) 0.723 (0.12)

47 donde k es la constante de inactivación, y E la dosis de UV aplicada Cepa E.coli O157:H7 (EDL 933) inoculada en Jugo de manzana estéril a 0.7mm con agitación 0.7mm sin agitación 2.8 mm con agitación 2.8 mm sin agitación Símbolos cerrados Nivel de inóculo inicial 106 CFU/ml Símbolos abiertos= Nivel de inóculo inicial 104 CFU/ml Log N/No = - k E donde k es la constante de inactivación, y E la dosis de UV aplicada La cinética de inactivación es independiente del N0

48 Espesor de película a irradiar (mm)Parámetro D = 1/k (Dosis de UV necesaria para reducir la población microbiana en un 90%) E.coli O157:H7 EDL 933 Espesor de película a irradiar (mm) 0.7 2.8 Con agitación Sin agitación DSMAC DTSA Jugo de Manzana 0.02 (0.001) 0.03 (0.002) 0.59 (0.02) 0.99 (0.04) 1.23 1.51 5.26 (0.19) 6.67 (0.13) Jugo de Naranja 0.07 0.11 (0.006) 1.31 (0.10) 2.50 (0.06) 2.85 (0.03) 3.70 (0.14) 8.33 (0.49) 16.60 (0.55) Jugo Multifrutas 0.16 (0.008) 0.19 2.78 (0.08) (0.17) 4.54 (0.12) 7.69 (0.35) 14.28 (0.61) 20.00 (0.60) Los valores de D resultaron entre 1.2 y 1.8 veces mayores en TSA que en SMAC.

49 Por otra parte.... Alimentos con mayor coeficiente de absortividad presentaron menor letalidad para ambas cepas de E. coli. La inactivación por UV depende del producto de la intensidad por el tiempo de exposición, es decir de la dosis (J/cm2). La agitación del alimento conjuntamente con el menor espesor de la película de líquido (0.7mm) presentó el mayor efecto bactericida. Se recomienda el empleo de TSA como medio de cultivo para la recuperación de células sometidas a la acción de la radiación UV.

50 Igualmente para SMAC y para ATCC 259222.8mm (0 rpm) 2.8mm (220 rpm) 0.7mm (0 rpm) 0.7mm (220 rpm) Manzana Naranja Multifruta Igualmente para SMAC y para ATCC 25922 Relación entre coeficientes de absortividad y valores de D obtenidos para E.coli O157:H7 EDL 933. Medio de Cultivo: TSA Relación lineal entre los coeficientes de absortividad y los valores de D para ambas cepas de E.coli.

51 Cual es la influencia del contenido de levaduras presentes en el jugo de naranja, en la inactivación de cepas STEC por acción del UV ??

52 La presencia de levaduras en el jugo de naranja, podría aumentar el coeficiente de absortividad, disminuyendo la acción de la radiación UV Jugo de naranja exprimido almacenado a 20ºC hasta alcanzar diferentes rangos de concentraciones de levaduras Rango de levaduras en el jugo de naranja (UFC/ml) Coeficiente de Absortividad 1.0x101 – 5.0x102 ± 5.1x102 – 5.0x103 ± 5.1x103 – 8.0x104 ± 8.1x104 – 2.0x106 ±

53 N0 = 107 UFC/ml; espesor de película= 0.7mm; agitación (220 rm)5 cepas del serotipo O157:H7 de diferente origen Inoculación en jugo de naranja exprimido con diferentes rangos de concentraciones de levaduras Condiciones: N0 = 107 UFC/ml; espesor de película= 0.7mm; agitación (220 rm) Dosis de UV= entre 0 y 2 J/cm2; Intensidad= 4.8m  0.5 W/cm2; Recuento de sobrevivientes= TSA; TºC de tratamiento= 4 y 20ºC.

54 Concentración de levaduras presentes en el jugo de naranja (UFC/ml)Cepa de E. coli O157:H7 Concentración de levaduras presentes en el jugo de naranja (UFC/ml) 1.0x101–5.0x102 5.1x x103 5.1x103 – 8.0x104 8.1x104– 2.0x106 D20ºC (J/cm2) D4ºC (J/cm2) 303/00 0.296 (0.008) 0.311 (0.001) 0.3232 (0.0001) 0.339 (0.001) 0.358 (0.001) 0.375 (0.001) 0.418 (0.001) 0.439 (0.0005) 749/03 0.169 (0.003) 0.190 (0.004) (0.0004) 0.215 (0.0003) 0.244 (0.0003) 0.271 (0.001) 0.278 (0.001) 0.324 (0.001) 547/03 0.210 (0.0003) 0.233 (0.0003) 0.2421 (0.0004) 0.262 (0.0004) 0.280 (0.001) 0.299 (0.0005) 0.327 (0.0004) 0.357 (0.001) 33/98 0.168 (0.004) 0.191 (0.005) 0.1970 (0.007) 0.217 (0.005) 0.235 (0.0004) 0.261 (0.0005) 0.275 (0.001) 0.306 (0.001) EDL 933 0.212 0.2441 (0.0002) 0.272 (0.001) 0.298 (0.0005) 0.317 (0.0005) 0.346 (0.001) 0.363 (0.001) Solo reduciría 3.54 log (NO cumple con la FDA) 5D= 1.48 J/cm2 Valores de D (D = 1/k) para cepas de E. coli O157:H7 inoculadas en en jugo de naranja exprimido, conteniendo diferentes concentraciones de levaduras, empleando 20ºC y 4ºC como temperatura de tratamiento.

55 Los valores de D aumentan con el incremento de la concentración de levaduras presentes en el jugo, ya que aumentan la absortividad del sistema, independientemente de la temperatura de tratamiento con UV. Las cepas de E. coli O157:H7 presentan una mayor resistencia al UV cuando el tratamiento se realiza a 4C.

56 Qué capacidad poseen las cepas de EQué capacidad poseen las cepas de E.coli de reparar los daños producidos por la acción del UV ??

57 Mecanismos de reparación de daños provocados por la radiación UV:Foto-reparación: se lleva a cabo en presencia de luz visible. Reparación en oscuridad: se realiza en ausencia total de luz. Importante a la hora de seleccionar las características de los envases (translúcido u opaco) empleados para el almacenamiento de jugos de naranja tratados con UV.

58 Reparación en oscuridad Foto-reparaciónJugo de Naranja exprimido pasteurizado, inoculado con 107 UFC/ml de cepas de E.coli (n=10) 1 3 2 Tratamiento con UV* Tratamiento con UV* Tratamiento con UV* Recuento de sobrevivientes en TSA (Control) 120 min bajo 4 fluorescentes “luz día” 120 min en oscuridad Recuento de sobrevivientes en TSA Recuento de sobrevivientes en TSA * Dosis entre 0 y 1.60 J/cm2 Reparación en oscuridad Foto-reparación

59 ■= Reparación en oscuridad ▲= Reparación en presencia de luzTodas las cepas presentan la capacidad de reparar los daños producidos por el UV en condiciones de exposición a la luz, no así en condiciones de oscuridad. = Sin reparación ■= Reparación en oscuridad ▲= Reparación en presencia de luz

60 Sería recomendable el mantenimiento de jugos de naranja exprimidos, tratados con UV en envases no permeables a la luz, ya que las cepas de E.coli poseen la capacidad de reparar los daños provocados por el tratamiento con UV cuando se encuentran expuestas a la luz por períodos de 2 horas, no así en ausencia total de la misma.

61 Cual es el tiempo de vida útil de los jugos de naranja tratados con UV ??

62 Temperatura de almacenamiento (ºC) Sin tratamiento (Control)Tratamiento aplicado Temperatura de almacenamiento (ºC) 4 10 20 Vida útil (días) Sin tratamiento (Control) >15 6.3  0,2 2.6  0.1 E= 1.60 J/cm2; I= 3.3 mW/cm2; TºC de tratamiento= 20 14.8  0.5 2.8  0.1 E= 1.60 J/cm2; I= 3.3 mW/cm2; TºC de tratamiento= 4 13.7  0.1 2.7  0.1 E= 1.60 J/cm2; I= 4.8 mW/cm2; TºC de tratamiento= 20 14.3  0.3 3.3  0.1 E= 1.60 J/cm2; I= 4.8 mW/cm2; TºC de tratamiento= 4 14.8  0.6 2.9  0.1 Los jugos de naranja tratados con UV y almacenados a 4 y 20ºC, presentan una mayor vida útil que los jugos sin tratamiento tanto Las intensidades así como la temperatura de tratamiento, no influyeron en forma significativa en el tiempo de vida útil.

63 La aplicación de radiación UV constituye una alternativa interesante para el tratamiento de jugos de naranja exprimidos, ya que disminuye los niveles de cepas patógenas de E.coli obteniendo productos seguros.

64 El tratamiento de elección para jugos de naranja exprimido resultaría ser:Aplicación de dosis de 1.60 J/cm2, Intensidades de 4.8mW/cm2 y 4ºC como temperatura de tratamiento, empleando películas de 0.7mm y agitación. Con dichas condiciones se logró: Obtener jugos de naranja con una mayor vida útil que los jugos sin tratamiento cuando estos se almacenan a 4ºC o 10ºC en condiciones de oscuridad.

65 Obtener jugos con una retención de ácido ascórbico del orden del 90% al final de su vida útil.Obtener un producto de buena aceptación por parte de los consumidores. Obtener un producto seguro desde el punto de vista microbiológico ya que además de provocar disminuciones de 5log en E.coli O157:H7, actúa disminuyendo la carga de microorganismos de deterioro propios del jugo.

66 Muchas Gracias por su atención !!