1 Chemia bioanalitycznaMagdalena Maj-Żurawska S.R. Mikkelsen, E. Corton, „Bioanalytical chemistry”, Wiley Inc., USA, 2004 V.A. Gault, N.H. McClenaghan, „Understanding bioanalytical chemistry”, Wiley-Blackwell, UK, 2009

2 Treść wykładu Analiza próbek biologicznych BioczujnikiZastosowanie chemii bioanalitycznej w diagnostyce medycznej i badaniach farmaceutycznych

3 Analiza próbek biologicznychSelektywne oznaczenie zawartości konkretnego związku (enzym, przeciwciało, stwierdzenie obecności lub nieobecności DNA o znanej sekwencji zasad w próbce) Scharakteryzowanie matrycy biologicznej (oszacowanie całkowitej zawartości różnych związków biologicznych) w próbce

4 Bioczujniki Zastosowanie związków biologicznych (enzym, DNA) jako składników części receptorowej czujników chemicznych

5 Scharakteryzowanie matrycy biologicznejOszacowanie całkowitej zawartości białek i kwasów nukleinowych

6 Zalety: Metoda jest szybka Wady: Interferencje innych związków absorbujących przy 260 i 280 nm (np. fenol) Nie rozróżnia DNA i RNA Użyteczna dla próbek o dużej zawartości białek i kwasów nukleinowych

7 Kolorymetryczne i fluorymetryczne metody oznaczaniaCałkowite stężenie białek DNA RNA Węglowodany Wolne kwasy tłuszczowe Metody oparte na tworzeniu chromoforów lub fluoroforów podczas selektywnej reakcji chemicznej

8

9 Całkowite stężenie białekCu2+ tworzy w środowisku alkalicznym kompleks z atomami N wiązań peptydowych z jednoczesną redukcją do Cu+. Dodany w nadmiarze ligand BCA tworzy kompleks z Cu+ o purpurowej barwie, o maksimum absorpcji przy 562 nm będący podstawą oznaczenia.

10 Całkowite stężenie białek (BCA)Granica wykrywalności: 0,2 mikrograma/0,01 cm3 Interferencje: kwasy, związki kompleksujące Cu (np. duże stężenie fosforanów), reduktory (np. redukujące cukry, tiole), Tris, siarczan amonu, edta, tłuszcze i fosfolipidy

11 Całkowite stężenie białekZnacznik reaguje z pierwszorzędowymi aminami w białku tworząc fluorofor, który wzbudza się przy 390 nm i emituje przy 475 nm. Granica wykrywalności: 10 nanogramów/0,01 cm3 Interferencje: aminy (1- i 2-rzędowe), Tris, siarczan amonu BSA – bovine serum albumin, albumina surowicy krwi wołowej

12 DNA

13 Całkowite stężenie DNAMetoda z kwasem diaminobenzoesowym: Próbka + 1 M HClO4 10 min (usunięcie puryn, uwolnienie deoksyrybozy i przekształcenie do aldehydu -hydroksylevulinylowego Dodanie kwasu 3,5-diaminobenzoesowego (DABA), 60 st.C, 30 min:

14 Całkowite stężenie DNAProdukt reakcji absorbuje promieniowanie z maksimum przy 420 nm Można również mierzyć fluorescencję przy 520 nm po wzbudzeniu przy 420 nm (liniowa kalibracja 10 – 500 ng total DNA – 1 – 50 mikrogramów/cm3) Reakcja jest specyficzna dla DNA, przeszkadza obecność tłuszczów, cukrów, soli i detergentów (Triton X-100). Oddziela się je od DNA przez wytrącenie w etanolu.

15 Całkowite stężenie DNA Inne metody fluorymetryczneOznaczanie dsDNA w ekstraktach tkanek: – niekowalencyjne oddziaływania ze związkami interkalującymi w wodnych roztworach o obojętnym pH Związki wykazują fluorescencję w roztworach wodnych, która znacznie wzrasta po związaniu DNA. (a) wiąże się z DNA i RNA, (b) i (c) – tylko z DNA. Granica oznaczalności z użyciem (c) – 10 ng dsDNA (1 mikrogram/cm3)

16 Całkowite stężenie DNA Inne metody fluorymetryczneOznaczanie ssDNA: Terb(III) Tb3+ koordynuje do nukleotydu deoksyguanozyno-5-fosforanu w środowisku o pH 6 wywołując fluorescencję przy 488 nm po wzbudzeniu przy 290 nm. Uzyskano liniową zależność fluorescencji w zakresie 1 – 10 mikrogram/cm3 ssDNA uzyskanego przez termiczną denaturację DNA z wątroby szczura.

17 Cząsteczki RNA zawierają zamiast tyminy - uracyl

18 Całkowite stężenie RNAJedyna używana metoda polega na usunięciu puryn w 85% H2SO4 (24 h 40 st.C); powstałe rybozofosforany ulegają defosforylacji i dehydratacji tworząc furfural; po dodaniu orcinolu powstaje związek absorbujący przy 500 nm. Nie przeszkadzają białka ani DNA.

19

20 Całkowite stężenie węglowodanówW oznaczaniu cukrów posiadających grupę aldehydową wykorzystuje się reakcje redoks stosując utleniacze takie jak Cu2+ (w obecności BCA) lub Fe(CN)63- W metodach oznaczania całkowitego stężenia cukrów stosuje się mocne kwasy w celu hydrolizy oligo- i polisacharydów i ich dehydratacji do aktywnych związków jak np. furfural. Fe(CN) nm, 1 – 30 mikrogram/cm3 492 nm, 10 – 200 mikrogram/cm3

21 Całkowite stężenie węglowodanówPowstaje silnie fluorescencyjny związek 2-(2-furyl)benzotiazol, ulegający wzbudzeniu przy 361 nm i emitujący przy 411 nm, zakres oznaczania: 0,5 – 6 mikrogram/cm3

22 Całkowite stężenie węglowodanówPolisacharydy zawierające podstawione lub niepodstawione glikole można oznaczyć stosując reakcję z jodanem (VII) sodu. Powstały produkt absorbuje przy 550 nm (max); granica wykrywalności 15 mikrogramów/cm3 wyznaczona w analizie naturalnych polisacharydów bakteryjnych z Salmonella pneumoniae

23 Obrazy kopiowane przez PrtSc

24 Wolne kwasy tłuszczoweWiększość metod oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych polega na tworzeniu pochodnych i stosowaniu chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Stosowana jest metoda kolorymetryczna do oznaczania wolnych kwasów tłuszczowych o długich łańcuchach węglowych (C>10) w osoczu krwi. Podstawą oznaczenia jest powstanie mydeł kobaltowych wolnych kwasów tłuszczowych rozpuszczonych w chloroformie. Absorbancję mierzy się przy 435 nm. Liniowa kalibracja uzyskana dla kwasu palmitynowego ma zakres 0,1 – 1,2 mikromola/dcm3. Białka i większość metabolitów nie przeszkadza, przeszkadzają duże stężenia fosfolipidów (np. lecytyna)

25

26

27

28

29