1 Chromatografia powinowactwa Affinity Chromatography - ACprof. M. Kamiński 2017 Zasady chromatografii powinowactwa Chromatografia powinowactwa polega na wykorzystywaniu specyficznych reakcji chemicznych pomiędzy reaktywnymi chemicznie ligandami związanymi z powierzchnią adsorbentu, a określonymi składnikami roztworu rozdzielanego, o określonej, nietypowej strukturze molekularnej. Wykorzystuje zdolność białek do swoistych wiązań: enzymów z ich substratami receptorów z ligandami przeciwciał z antygenami Specyficzną odmianą jest tzw. chromatografia metalo-powinowactwa, zwłaszcza Ni -powinowactwa
2 Zasady chromatografii powinowactwaSorpcja wyłącznie określonych struktur molekularnych, na zasadzie „zamek – klucz”; Sorbowane są tylko te struktury molekularne, które „pasują” do struktury „matrycy” sorpcyjnej Następnie ma miejsce przepłukanie złoża „buforem, w celu usunięcia składników mieszaniny z przestrzeni międzyziarnowej oraz z przestrzeni porów wewnątrz-ziarnowych. Kolejno odszczepienie „analitu”, bez zmiany struktury molekularnej „matrycy” i jej przygotowanie do kolejnego związania na zasadzie powinowactwa Specyficzne wiązanie makromolekuł, np. przeciw-ciał Specyficzne wiązanie małych molekuł, np. do immobilizowanych przeciw-ciał
3 Chromatografia powinowactwa - zastosowanie do izolowania i oczyszczania substancji biologicznie aktywnych. Jest typem chromatografii adsorpcyjnej, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Ze względu na swoje właściwości, metoda ta pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji, przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności. Jako metoda szybka i skuteczna, chromatografia powinowactwa znalazła bardzo szerokie zastosowanie, jednak jak każda z metod posiada zarówno wady jak i zalety stosowania [2]. Zalety metody chromatografii powinowactwa - metoda ta nie jest obciążona ograniczeniem w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę próbki -w metodzie tej istnieje możliwość silnego zatężania izolowanej próbki, a ponadto chromatografia ta charakteryzuje się bardzo wysoką specyficznością - ponadto istnieje możliwość uzyskania czystej postaci molekuły, które bardzo często nie mogą być izolowane z wykorzystaniem innych metod - wyizolowany materiał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości i to pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego w całej procedurze [2]. Wady chromatografii powinowactwa - trudności z uzyskaniem niektórych specyficznych ligandów - częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie - niska trwałość niektórych ligandów [2].
4 Chromatografia powinowactwa stosowana jest do rozdziału białek ze względu na ich duże powinowactwo do specyficznych ligandów, które związane są z nierozpuszczalnym złożem. Procedura obejmuje następujące etapy: -- kowlaencyjne przyłączenie ligandu do złoża nałożenie mieszany białek, -- przemycie kolumny w celu usunięcia niezwiązanych cząsteczek, -- elucja związanych z kolumną białek. Kilka najbardziej popularnych oddziaływań międzycząsteczkowych wykorzystywanych w chromatografii powinowactwa. Związki oczyszczane Ligandy związane ze złożem Enzymy inhibitory, koenzymy, substraty Receptory hormony, witaminy, toksyny Przeciwciała antygeny, hapteny Pektyny cukry, polisacharydy, glikoproteiny Kwasy nukleinowe nukleotydy, represory Rysunek Białka o dużym powinowactwie do liganda (związanego ze złożem) łączą się ze złożem. Natomiast białka nie wykazujące takiego powinowactwa są wypłukiwane z kolumny.
5 Właściwości ligandów -- co najmniej jedna grupa aktywna, która umożliwia związanie do złoża np. aminowa, amidowa, karboksylowa, hydroksylowa, tiolowa powinowactwo do związku oczyszczanego stabilność w warunkach reakcji wiązania do złoża Wiązanie ligandów Ligandy mogą być połączone bezpośrednio ze złożem lub poprzez „ruchome ramię” (spacer arm) w celu wyeliminowania niepożądanych oddziaływań sterycznych ligand-złoże. Poprzez ramię łączy się ligandy o niskiej masie cząsteczkowej oraz takie, do których przy bezpośrednim połączeniu dostępność będzie ograniczona. Zwykle jako ramię stosuje się nie rozgałęziony łańcuch węglowodorowy, lub poli-eterowy, na którego końcu znajduje się grupa aktywna za pomocą której łączy się ligand. Aktywacja złoża: złoże takie jak: celuloza, agaroza, sephadex, poliakrylamid i inne: aktywuje się z użyciem następujących odczynników (w nawiasach podano rodzaje wiązanych za pomocą tych odczynników ligandów): aldehyd glutarowy (białka, kwasy nukleinowe, aminy), bromek cyjanu (białka, kwasy nukleinowe, aminy), siarczan dwuwinylu (wielocukry, aminy, grupy tiolowe i fenolowe) benzochinon (białka, wielocukry, aminy) nadjodan (białka, kwasy nukleinowe, aminy) trójchloro-s-triazyna (białka, wielocukry, aminy), hydrazyna (białka, kwasy nukleinowe, aminy), epichlorohydryna (wielocukry, kwasy nukleinowe, aminy, grupy tiolowe i fenolowe).
6 Elucja białek z kolumnyBiałka związane z kolumną eluuje się odpowiednim buforem najczęściej w jedno lub pół mililitrowych frakcjach. Jako bufor elucyjny najczęściej stosuje się: - roztwór liganda np.: konkanawalina A, ma powinowactwo do glukozy; można ją oczyścić na kolumnie z kowalencyjnie połączonymi resztami glukozy; białko można uwolnić z kolumny poprzez elucję stężonym roztworem glukozy; - roztwory zawierające jony chaotropowe najczęściej 3M roztwór rodanku potasu; złoże doprowadzić do temperatury pokojowej i zrównoważyć buforem, który będzie użyty do łączenia z ligandem (bufor do łączenia); - roztwory o niskim pH np. bufor octanowy o pH 3.0, bufor glicynowy o pH 2.5-3 roztwory mocznika lub siarczanu dodecylu; W przypadku denaturacji białka podczas procesu elucji należy pamiętać, aby proces elucji przeprowadzić możliwie jak najszybciej oraz możliwie szybko usunąć czynnik denaturujący z eluowanego białka np. poprzez podwyższenie pH roztworu
7 Przykład „matryc” / specyficznych „ligandów” / wiązanych grup funkcyjnych
8 Przykład procedury immobilizacji białka na „agarozie”aktywowanej bromkiem „cyjanogenu”
9 Wykaz matryc / ligandów i ich struktur po immobilizacji
10 Przykład procedury badawczej z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa (AC) oraz z wykonaniem kontroli analitycznej z zastosowaniem elektroforezy żelowej (GE)
11 Chromatografia metalo-powinowactwa z wykorzystaniem wiązania histydyny do jonu Ni+2 immobilzowanego na powierzchni porów matrycy o charakterze wymieniacza kationów Poniżej kontrola efektywności rozdzielania z zastosowaniem elektroforezy żelowej (GE)
12 Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwaPrzykład procedury postępowania z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa Procedura oczyszczania przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa obejmuje następujące etapy: -- Aktywacja złoża -- Przyłączenie ligandu (w tym wypadku specyficznego do przeciwciał antygenu) do powierzchni aktywnej kolumny -- Opłukanie niezwiązanego z kolumną ligandu i wysycenie pozostałych aktywnych miejsc na kolumnie -- Zrównoważenie kolumny, naniesienie surowicy i inkubacja kolumny z surowicą -- Od-płukanie niezwiązanych cząsteczek -- Elucja swoistych przeciwciał Aktywacja złoża, wiązanie ligandu i wysycanie pozostałych aktywnych miejsc w kolumnie W kolumnie z odpowiednim złożem (np. agaroza, sephadex, ...) łączy się ligand poprzez grupy ~SH. Białko powinno zawierać więcej niż 50% wolnych grup SH. Jeśli jest mniej należy białko „zredukować” (np. MET) w celu zwiększenia zawartości wolnych grup SH. 2. Przyłączanie ligandu do zaktywowanego złoża (inkubacja złoża z rozpuszczonym l igandem) 3. Wysycanie pozostałych aktywnych miejsc na złożu (inkubacja kolumny z etanoloaminą lub innymi aminami takimi jak: lizyna, glukozamina aby usunąć z kolumny pozostałe grupy aktywne nie połączone z ligandem). Połączone z ligandem złoże przechowuje się w obecności 0,02% azydku sodu lub mertiolatu w temperaturze 4°C.
13 W kolumnie z odpowiednim złożem (np. agaroza, sephadex,W kolumnie z odpowiednim złożem (np. agaroza, sephadex, ...) łączy się ligand poprzez grupy ~SH. Białko powinno zawierać więcej niż 50% wolnych grup SH. Jeśli jest mniej należy białko zredukować (np. MET) w celu zwiększenia zawartości wolnych grup SH. Wybrane złoże doprowadzić do temperatury pokojowej i zrównoważyć buforem, który będzie użyty do łączenia z ligandem (bufor do łączenia). Nanieść roztwór ligandu w buforze do łączenia. Używać około 1ml roztworu na 1ml żelu. Pozostawić niewielką ilość roztworu do pomiaru ilości białka. Inkubacja 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem zawartości kolumny. Po czym inkubacja godzinę bez mieszania. Przemyć kolumnę buforem użytym do łączenia ligandu (około 3 objętościami kolumny). Wyciek z kolumny i ostatnie płukanie zachować do pomiaru białka. Zmierzyć ilość białka z punktu nr 2 (w celu sprawdzenia efektywności wiązania ligandu), 4 i 5 przy długości fali 280 nm. Nanieś bufor do wysycania kolumny na każdy 1 ml kolumny 1 ml buforu. 15 minut delikatnie mieszać zawartość kolumny w temperaturze pokojowej a następnie inkubować jeszcze godzinę w temperaturze pokojowej bez mieszania. Przemyć kolumnę buforem do przemywania (około 6 objętości kolumny) a następnie buforem do przechowywania kolumny (około 2 objętości kolumny). Przechować kolumnę związaną z ligandem w buforze do przechowywania kolumny w objętości około 2 ml buforu ponad złoże w temperaturze 4°C.
14 Elucja białek z kolumnyBiałka związane z kolumną eluuje się odpowiednim buforem najczęściej w jedno lub pół-mililitrowych frakcjach. Jako bufor elucyjny najczęściej stosuje się roztwór liganda np.: konkanawalina A, ma powinowactwo do glukozy. Można ją oczyścić na kolumnie z kowalencyjnie połączonymi resztami glukozy. Białko można uwolnić z kolumny poprzez elucję stężonym roztworem glukozy. Roztwory zawierające jony chaotropowe najczęściej 3M roztwór rodanku potasu - Wybrane złoże doprowadzić do temperatury pokojowej i zrównoważyć buforem, który będzie użyty do łączenia z ligandem (bufor do łączenia). Roztwory o niskim pH np. bufor octanowy o pH 3.0, bufor glicynowy o pH (Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa) - roztwory mocznika lub siarczanu dodecylu. W przypadku denaturacji białka podczas procesu elucji należy pamiętać, aby proces elucji przeprowadzić możliwie jak najszybciej oraz możliwie szybko usunąć czynnik denaturujący z eluowanego białka np. poprzez podwyższenie pH roztworu Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa lub poprzez dializę.