1 CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000iRaúl Gil Orts R2 Análisis Clínicos
2 INTRODUCCIÓN Principios Citometría de flujo - ¿Qué podemos analizar?- ¿Qué parámetros? - ¿Cómo funciona? UF-1000i Análisis de las células de orina Interpretación de los resultados
3 PRINCIPIOS - Emplea la citometría de flujo para analizar los elementos contenidos en la orina - Discrimina y clasifica en función del grado de fluorescencia y dispersión de la luz
4 CITOMETRIA DE FLUJO Es un método analítico por el que se mide la emisión de múltiples fluorescencias y la dispersión de luz de células o partículas microscópicas, alineadas secuencialmente mediante una corriente líquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a gran velocidad frente a un haz de luz láser de longitud de onda adecuada
5 CITOMETRÍA DE FLUJO: ´¿QUÉ PODEMOS ANALIZAR?Nivel molecular Proteínas extracelulares Secuenciasde ADN o ARN libres Complejos inmunes circulantes Nivel Subcelular Viriones individuales Liposomas Cromosomas aislados Orgánulos aislados Núcleos aislados Nivel Celular Bacterias Hongos unicelulares Células humanas y animales Protoplastos vegetales Nivel supracelular Hibridomas y fusiones celulares Esferoides Organismos pluricelulares
6 CITOMETRÍA DE FLUJO: ¿QUÉ PARAMETROS PODEMOS ANALIZAR?Parámetros nucleares Parámetros citoplasmáticos: Proteínas Enzimas Parámetros extracelulares: Proteínas secretadas Parámetros de superficie: Moléculas de superficie Pared celular
7 CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000i: ¿CÓMO FUNCIONA?Fluido células en suspensión Reactivo envolvente Reactivo envolvente Análisis Señal óptica: Luz dispersa Luz Fluorescente DIAGRAMAS DISPERSIÓN HISTOGRAMAS
8 CITÓMETRO DE FLUJO UF-1000i: PARTESUnidad principal Muestreador Unidad de proceso de la información
9 Sistema óptico SISTEMA DE LUZ FLUORESCENTE LATERAL SISTEMA DE LUZDISPERSA LATERAL SISTEMA DE LUZ DISPERSA FRONTAL
10 FLUJO DEL REACTIVO ENVOLVENTESE INTRODUCIE UN FLUIDO ENVOLVENTE PRESURIZADO - FORMA UN TÚNEL LÍQUIDO PERMITE LA ENTRADA DE LAS CÉLULAS - DE UNA EN UNA - EVITA LA FORMACIÓN DE COÁGULOS ESTOS 2 FLUIDOS NO SE MEZCLAN MEJORA LA PRECISIÓN Y LA REPRODUCIBILIDAD DEL RECUENTO - IMPIDE LA CONTAMINACIÓN DE LA CÉLULA DE FLUJO
11 FLUJO DEL REACTIVO ENVOLVENTEEvitar
12 SISTEMA ELECTRICO UNIDAD PRINCIPAL HISTOGRAMA ERITROCITOS LEUCOCITOSLUZ DISPERSA FRONTAL LUZ FLUORESCENTE UNIDAD DE PROCESAMIENTO LUZ DISPERSA FRONTAL LUZ DISPERSA LATERAL LUZ FLUORESCENTE DIAGRAMA DE DISPERSIÓN
13 ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS DE ORINAPrincipios del análisis Formas de onda Información - tamaños celulares Estado superficie -características tinción Análisis -altura - amplitud - inclusiones - otros factores célula Clasificacion de las células
14 ANÁLISIS DE LAS CÉLULAS DE ORINASEÑAL DE LA LUZ DISPERSA LATERAL La señal de la luz refleja el estado de la superficie de las células Refleja la intensidad y la longitud de la tinción del núcleo citoplasma membranas bacterias SEÑAL DE LA LUZ FLUORESCENTE SEÑAL DE LA LUZ DISPERSA FRONTAL La señal de la luz dispersa frontal refleja la información sobre el tamaño de las partículas
15 Parámetros Parámetros de análisis (Elementos formados) RBC: EritrocitoWBC: Leucocito EC: Célula epitelial CAST: Cilindro BACT: Bacteria Parámetros de aviso y estudio (elementos cuantitativos) X´TAL: Cristal YLC: Célula levaduriforme SRC: Célula redonda pequeña Path. CAST: Cilindro patológico MUCUS: Mucosidad SPERM: Espermatozoides Cond.: Conductividad
16 Diagramas dispersión
17 Diagramas de dispersión
18 Patrones de histogramasLa intensidad de la luz dispersa frontal y de la luz fluorescente se combinan con el número de células de la orina clasificadas
19 Interpretación de resultadosRBC Generalmente no se requiere comprobar el recuento con microscopia manual En caso de discrepancia con la tira: verificar si densidad o la conductividad son bajas. Posible lisis - Interferencias de X´TAL contados como RBC: verificar diagrama dispersión. Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad RBC/X´TAL - Interferencias de YLC clasificadas como RBC: verificar diagrama dispersión Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad RBC/YLC - Cut-off: 25 RBC/microL WBC: En recuentos elevados se pueden presentar fragmentos de WBC por lisis parcial que pueden clasificarse como BACT o YLC Cut-off: 40 WBC/microL
20 Interpretación de resultadosEC/SRC Recuento elevado de SRC: proceder a microscopía manual. EC sin alarma de SRC, no provee valor diagnóstico y puede indicar baja calidad de la muestra, por ejemplo por contaminación. Da información sobre poca fiabilidad del recuento de BACT. CAST/Path CAST En caso de PRO elevadas en la tira sin alarma de CAST en el UF: revisar al microscopio Los CAST hialinos pueden verse interferidos por el MUCUS BACT Recuentos son específicos del canal de BACT, sin embargo se pueden encontrar otras partículas que pueden ser fuente de interferencia: verificar el diagrama de dispersión -Comprobar si UF ha mostrado alarma de baja fiabilidad RBC/BACT.
21 Interpretación de resultadosYLC Si se observan recuentos elevados en comparación con la microscopía: verificar en el diagrama de dispersión la existencia de solapamiento con el área de RBC; verificar la excesiva extensión del área OTHERS. X´TAL En caso de posible interferencia con RBC, verificar el diagrama de dispersión.
22 GRACIAS