1 Clonación y secuenciación del DNA
2 Clonación y secuenciación del DNADeberán quedar bien claros los siguientes puntos: ¿Cómo se manipula el DNA? Las endonucleasas (enzimas) de restricción Mapas de restricción Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción Clonación del DNA: DNA foráneo, vector de clonación, organismo huésped, selección de vectores Métodos de detección a partir de una sonda de DNA: transferencia en Southern, sondeo de un gen clonado Vectores eucarióticos Organismos transgénicos La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La secuenciación del DNA Clonación y secuenciación del DNA
3 Manipulación del DNA Estudio de una secuencia específica de DNA que suele encontrarse en un conjunto heterogéneo de secuencias. Aislamiento, amplificación, secuenciación y expresión de un fragmento de DNA específico La nueva tecnología se denomina: Tecnología del DNA recombinante, clonación génica o ingeniería genética Ningún campo de la biología ha permanecido igual tras esta revolución tecnológica Propiedad básica del DNA que permite su manipulación: El acoplamiento de cadenas por complementariedad. La extraordinaria especificidad del reconocimiento entre secuencias de bases complementarias constituye un poderoso instrumento para la identificación, aislamiento, clonación,... De fragmentos de DNA complementarios a uno dado Clonación y secuenciación del DNA
4 Clonación y secuenciación del DNAHerramienta básica Endonucleasas (enzimas) de restricción -> Enzimas de bacterias que reconocen secuencias de DNA específicas y lo cortan por el esqueleto azúcar-fosfato. Tipo I y III: cortan el DNA en puntos distintos al de reconocimiento (al azar) Tipo II: cortan justo en los puntos que reconocen, que son repeticiones invertidas o palíndromes 5´-GGATCC- 3´ 3´-CCTAGG- 5´ Clonación y secuenciación del DNA
5 Clonación y secuenciación del DNADos tipos de cortes: Corte plano: extremos romos Corte escalonado: extremos pegajosos o cohesivos EcoRI: E. Coli BamHI: Bacillus amyloliquefaciens Clonación y secuenciación del DNA
6 Clonación y secuenciación del DNAHerramienta básica Las enzimas de restricción tipo II: Proporcionan una forma de cortar el DNA de cualquier origen en secuencias específicas, produciendo por tanto una población heterogénea de fragmentos de extremos idénticos Clonación y secuenciación del DNA
7 Población de fragmentosClonación y secuenciación del DNA
8 Separación fragmentosReptación de los fragmentos a través del gel de agarosa Clonación y secuenciación del DNA
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10 Clonación y secuenciación del DNASondeo de una secuencia de DNA en un conjunto heterogéneos de fragmentos Se precisa de una sonda marcada (radioactividad, colorantes fluorescentes,...), cDNA suele usarse como sonda Transferencia en Southern (Southern blotting) Transferencia Northern (Northern blotting): se hibrida con RNA Clonación y secuenciación del DNA
11 Transferencia en Southern (esquema resumen)Clonación y secuenciación del DNA
12 Clonación y secuenciación del DNAUso de la enzimas de restricción para la construcción de mapas de restricción Clonación y secuenciación del DNA
13 Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)Clonación y secuenciación del DNA
14 Clonación y secuenciación del DNAUsos de los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) Análisis de ligamiento que permite cartografiar y “cazar” genes asociados a enfermedades o rasgos fenotípicos (proyecto SNPs) Medicina forense: análisis de las huellas dactilares genéticas (DNA fingerprinting) Clonación y secuenciación del DNA
15 Clonación y secuenciación del DNAClonación del DNA DNA foráneo (secuencia que se desea clonar) Vector de clonación (vehículo) Organismo huésped (E. Coli) Selección de vectores Vector híbrido Clonación y secuenciación del DNA
16 Clonación y secuenciación del DNAClonación del DNA Vectores híbridos (quimera) Fragmentos de distintas procedencias que se unen in vitro tras cortarse con la misma enzima de restricción Vectores de clonación Plásmido (1 sitio de corte) 2-15 kb Fago (Lambda) Cósmido Clonación y secuenciación del DNA
17 Clonación y secuenciación del DNAClonación del DNA Vectores de clonación Fago (2 sitios de corte) < 24 kb Clonación y secuenciación del DNA
18 Clonación y secuenciación del DNAClonación del DNA Vectores de clonación Cósmido: extremos cos + DNA plásmido (origen replicación) + DNA foráneo + cápisde. ~50 kb Clonación y secuenciación del DNA
19 Clonación y secuenciación del DNAClonación del DNA Huésped: E. coli Inserción del vector híbrido en el huésped: Plásmido: transformación (solución diluida cloruro de calcio) y replicación autónoma Fago (transducción, inserción en DNA huésped) Cósmido (transducción como fago y replicación como plásmido) Clonación y secuenciación del DNA
20 Selección de vectores híbridosPlásmido: resistencia a antibióticos Fago : Inserción en E. coli (sólo se puede empaquetar el DNA de si contiene el inserto foráneo) Clonación del DNA Clonación y secuenciación del DNA
21 Obtención de la secuencia que se clonaClonación del DNA Obtención de la secuencia que se clona Un gen Aislamiento a partir del mRNA: uso de la transcriptasa inversa que hace cDNA Síntesis automatizada de DNA in vitro: a partir de la secuencia aminoacídica se puede hacer DNA con la ayuda del código (no región promotora ni controladora de la expresión) ~100bp Fragmentos del genoma por digestión con enzimas de restricción (perdigonada, Shotgun) Se obtiene genoteca, juego completo fragmentos clonados del genoma del organismo Clonación y secuenciación del DNA
22 Transfección: Introducción de DNA foráneo en eucariotasOrganismo transgénico: un eucariota con DNA foráneo Células eucariotas toman DNA foráneo del ambiente con fosfato cálcico (poco eficiente) Inyección en el oocito: DNA incorporado en el cromosoma (ratones transgénicos 15% eficiencia) Métodos transfección Clonación y secuenciación del DNA
23 Clonación y secuenciación del DNAMétodos transfección Retrovirus: parte de su genoma se reemplaza con DNA foráneo (ejemplo: leucocitos humanos carecen enzima adenosina desaminasa (ADA) se repararon por infección viral) Clonación y secuenciación del DNA
24 Clonación y secuenciación del DNAMétodos transfección Electroporación: se usa corriente eléctrica para introducir DNA Liposomas: DNA se encapsula en liposomas (vesículas de membrana artificial) Biolística (mitocondrias y cloroplastos): disparo de proyectiles de tungsteno recubiertos por DNA Plásmidos (Ti de Agrobacterium tumefaciens) y elementos móviles Clonación y secuenciación del DNA
25 Sistemas de detección del insertoSistemas marcadores (reporter systems): indican la expresión del gen insertado; p.e., enzima luciferasa de luciérnagas en plantas (el vector es el plásmido Ti de A. tumefaciens). Uso como marcador de la expresión de genes específicos Luciferina (substrato) + ATP -> luz -> luciferasa Clonación y secuenciación del DNA
26 Vectores eucarióticosPermite obtener las máximas ventajas de genes eucariotas Vectores de levaduras: cromosomas artificiales de levaduras (YACs): Plásmidos + Secuencia replicadora + centrómero de levadura + (telómero levadura) Puede incorporar más de 500 kb de DNA Origen de replicación del DNA de levadura (ARS) Región centromérica (CEN) Resistencia a antibiótico (p.e., ampr) Origen de replicación bacteriano (ori) Linealización (con endonucleasas) y adición de extremos teloméricos CEN ARS ampr ori Telómero Clonación y secuenciación del DNA
27 Vectores eucarióticosVectores animales: SV40, virus vacuolado del simio, de DNA, aunque partes cambiadas. Puede tranformar en cancerosas células conejo o hámster. Vectores de plantas: plásmido Ti de bacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens, inductor de tumores cuando se integra en DNA huésped (agallas en dicotiledóneas) Clonación y secuenciación del DNA
28 La reacción en cadena de la polimerasa (PCR)Clonación y secuenciación del DNA
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31 Clonación y secuenciación del DNASecuenciación de DNA La secuencia nucleotídica exacta de un fragmento de DNA permite un conocimiento más completo dela estructura y función de un gen. La base molecular de mutaciones específicas en un gen pueden investigarse Las secuencias del DNA han revelado regiones reguladoras comunes a todos los genes La comparación de secuencias de diferentes especies provee estimas de las tasas de evolución molecular Disoxi Métodos: Secuenciación manual Químico (Maxam y Gilbert 1977) Didesoxi (Sanger 1977) Secuenciación automatizada Didesoxi Clonación y secuenciación del DNA
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33 Secuenciación automatizada del DNAClonación y secuenciación del DNA
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