1 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCHPLC: High Performance Liquid Chromatography 1

2 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCDefinición: Técnica que realiza la separación de una mezcla de compuestos a través de la interacción selectiva entre los solutos, una fase estacionaria y una fase móvil, haciendo uso de instrumentación automatizada de alta eficiencia

3 Cromatografía en ColumnaDefinición: Técnica de separación que se lleva a cabo en una columna empacada con un soporte (gel de sílice o alúmina) 3

4 Cromatografía en ColumnaFase estacionaria: Silica gel (polar) Carbonato de calcio Almidón Alúmina (polar) Diámetro: mm Longitud: 5 cm – 1 m Tamaño μm. 63 – 200 μm.

5 Cromatografía en ColumnaFase móvil: Solventes utilizados en cromatografía en capa fina funcionan adecuadamente. Serie eluotrópica Pentano Éter de petróleo Hexano Ciclohexano Tetracloruro de carbono Tolueno Xileno Benceno Cloroformo Acetona Acetato de etilo Acetonitrilo Iso-propanol Metanol Agua Rubinson & Rubison Química Analítica Contemporánea

6 Cromatografía en ColumnaMecanismo de separación: K = CS/CM 6

7 Cromatografía en ColumnaTipos de cromatografía en columna: Cromatografía de intercambio iónico, la fase estacionaria esta formada de aniones (-SO3-) o cationes (-N(NH3)3+). Los iones con carga opuesta son retenidos en la fase estacionaria por fuerzas electrostáticas. Cromatografía de exclusión molecular, efectúa la separación de acuerdo al tamaño de las moléculas. La columna esta rellena de un soporte cuyos poros son del tamaño similar al tamaño de las moléculas de la muestra. Las moléculas pequeñas quedan retenidas en los poros mientras que las grandes no, siendo las primeras en salir de la columna. Cromatografía de afinidad: Es técnica cromatográfica selectiva , se basa en las interacciones especificas entre una clase de moléculas y una segunda molécula que esta unida covalentmetne a la fase estacionaria, por ejemplo un anticuerpos unido a una proteína, si la muestra contiene una proteína afín a la enlazada esta reacionará con el anticuerpo y se fija a este, la cual será liberad al modificar el pH dela fase móvil. Intercambio Iónico Exclusión Molecular Afinidad 7

8 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Cromatografía en columna Desventajas de la cromatografía en columna Diámetro: mm Longitud: 5 cm – 1 m Tamaño de partícula: 40 – 200 μm Grandes volúmenes de fase móvil Tiempos de análisis largos Gran tamaño de muestra La identificación y cuantificación por algún método no acoplado En cromatografía en columna la fase móvil se mueve por gravedad a través de la fase estacionaria, esto lleva a tiempos de análisis largos (horas) además las fracciones colectadas tienen que ser analizadas por algún método alargando así los tiempos de análisis. La mejor opción para reducir los tiempos de análisis es incrementar el flujo de la fase móvil ya sea por vacío o presión. Sin embargo esto lleva a perder eficiencia debido a que conforme se incrementa el flujo la altura del plato teórico se , reduciéndose el número de platos por columna. El 85 % de los compuesto son volátiles o semi-volátiles, para el resto es necesario encontrar otro método de separación. Aquí es donde entra la cromatografía de líquidos de alta resolución 8

9 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCAntecedentes históricos 1952 Premio Nobel de Química par Martin y Synge por el desarrollo de cromatografía líquido-líquido 1959 Primer trabajo de exclusión molecular aplicado a biopolímeros polímeros por Flodin y Porath 1960 Separación de solutos iónicos . Ionizables y neutros 1970 La técnica de HPLC se difunde ampliamente, la instrumentación se mejora Uso de modificadores de fase móvil para mejorar la eficiencia 1990 Se mejora la tecnología de fase reversa

10 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)1951 Martin y Synge: Sugieren que altas presiones de fase móvil y tamaño reducido de partículas puede mejorar notablemente la eficiencia en la cromatografía en columna. 10

11 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Instrumentación: Reservorio de fase móvil 11

12 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Reservorios de fase móvil Tubo de Teflón 1/8’’ Fase Móvil: Libre de partículas Filtrar en membranas de μm Libre de aire Recipiente de vidrio Filtro 12

13 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Sistema de bombea 13

14 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Sistema de bombeo de fase móvil Es el sistema mediante el cual la fase móvil se introduce através de la columna Características: Resistente a los solventes Amplio intervalo de flujos Facilidad de cambiar un solvente por otro De fácil manejo y mantenimiento 14

15 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Sistema de bombeo de fase móvil Sistema de bombeo a presión constante Bomba Neumática Sistema de bombeo a flujo constante Bomba tipo jeringa Bomba reciproca 15 15

16 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Bomba neumática 10 bar 16 16

17 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Bomba tipo jeringa Volumen de la cámara: 200 – 500 cm3 17

18 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Bomba reciproca La bomba reciproca es el sistema mas usado en HPLC. En este sistema el pistón se mueve por medio de un cabezal excéntrico cuando el pistón se retrae mueve la válvula check permitiendo la entrada de fase móvil a la cámara de solvente, mientras que se cierra la válvula check que va a la columna. Este sistema tiene una capacidad ilimitada y su volumen interno puede ser reducido de 10 – 100 μl 18 18

19 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)Bomba reciproca La bomba reciproca es el sistema mas usado en HPLC. En este sistema el pistón se mueve por medio de un cabezal excéntrico cuando el pistón se retrae mueve la válvula check permitiendo la entrada de fase móvil a la cámara de solvente, mientras que se cierra la válvula check que va a la columna. Este sistema tiene una capacidad ilimitada y su volumen interno puede ser reducido de 10 – 100 μl 19 19

20 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Puerto de inyección 20

21 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Puerto de inyección Válvula Rheodyne 21 21

22 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCCaracterísticas de la muestra Libre de partículas Filtrar en membranas de 0.45 μm 22 22

23 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne Loop de μl 23 23

24 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Puerto de inyección Diagrama de flujo válvula Rheodyne 24 24

25 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Columna 25

26 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Columna Acero ( Cr-Ni-Mo) Relativamente inerte a la corrosión química Longitud: 10, 12.5 o 15 cm Diámetro: 4.6, 6.2 o 9 mm Soporte: 10, 5, 4 o 3 μm 26

27 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Soporte Silica microporosa Permeable a solventes (fase estacionaria) Diámetros : μm Área superficial: 500 m2/g Fases estacionaria enlazada covalentemente a la silica 27 27

28 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCInstrumentación: Fase estacionaria Fase polar Fase no polar R= (CH2)3NH2 Amino R= (CH2)17CH3 Octadecilo R= (CH2)3C=N Ciano R= (CH2)7CH3 Octilo R= (CH2)2OCH2CH(OH)CH2OH Diol R= (CH2)3C6H5 Fenilo 28 28

29 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCModo de separación Fase Normal Fase Reversa Polaridad fase estacionaria Alta Baja Polaridad fase móvil Baja- media Media- alta Típica fase móvil Heptano/CHCl3 CH3OH/H2O Orden de elusión 1º Menos polar 1º Mas polar 29 29

30 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCVentajas Fase normal Fase reversa Separación de mezclas con polaridades diversas Rápido equilibrio de la columna con la fase móvil Fácil, rápido y reproducible Picos menos coleados Se estabiliza rápidamente a cambios de fase móvil Reproducible 30 30

31 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCFase móvil 31 31

32 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCModalidades de separación + + - - Isocrático Gradiente por etapas + - Curvas de gradiente 32 32

33 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCModalidades de separación Isocrático Gradiente Elución de picos mas rápido, ahorro de tiempo de análisis, mayor productividad 33 33

34 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCEfecto de la temperatura 34 34

35 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCEfecto del tipo de fase estacionaria 35 35

36 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCEfecto del flujo de fase móvil Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 36 36

37 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCEfecto del pH Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 37 37

38 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCEfecto del fase móvil 38 38

39 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCDetectores 39 39

40 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC40 40

41 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCTipo Respuesta Rango lineal Detecta UV/Vis Arreglo de diodos Selectivo Enlaces C-O, aromáticos, alquenos Florescencia 10-3 – 10-4 Hidrocarburos policíclicos Conductividad NO3-, NO2-, SO42-, Cl- Índice de refracción Universal Ácidos orgánicos, azúcares 41 41

42 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC42 42

43 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCCelda 43 43

44 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCLos estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 44 44

45 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCLos estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 45 45

46 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC46 46

47 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC47 47

48 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCLos estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 48 48

49 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC49 49

50 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC50 50

51 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC51 51

52 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC52 52

53 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLCAniones Los estudios de Martin y Synge en 1941, sientan las bases de la cormatografia de liquidos de lata resolución. de Ellosproponen introducir la fase móvil a presión así como reducir el tamaño de parrticula para conellos conseguir mejores eficiencias. Sin emabrga sus hayazgos fueron quedados en el olviado y reemplazdos por la CG, la cual evoluciona a grandes zancadas y no fue hasta que esta quedo bien establecida que se retomo la cromatografia de liquidos. 53 53

54 Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución HPLC54 54