1 CROMATOGRAFíA EN COLUMNALicda. Carol de Santisteban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

2 TIPOS, SEGÚN FM C. de líquidos C. de gases C. de fluidos supercríticos

3 C. De líquidos Todos los tipos de fases estacionarias y móviles.Diferentes posibilidades de mecanismos de separación, según tipo de fase estacionaria. Características esenciales de solventes: índice de polaridad (reparto) fuerza eluyente (adsorción)

4 Mecanismos de separaciónC. de adsorción C. de reparto C. de afinidad C. de intercambio iónico C. de exclusión molecular

5 Selección Fase estacionaria de acuerdo a interacciones posibles según naturaleza del analito Van der Waals  reparto fase reversa Polar  reparto fase normal Medianamente polar  adsorción Iónico  intercambio iónico Biomoléculas: Distribución de tamaños  exclusión molecular Distribución de cargas  intercambio iónico, otras Actividad biológica  afinidad Fase móvil de acuerdo a fase estacionaria e interacciones deseadas

6 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN

7 FASES ESTACIONARIAS Fase estacionaria adsorbenteCarbonato de calcio, Tswett Sílica, alúmina las más utilizadas actualmente Sílica > alúmina (capacidad de carga, variedad, reacciones indeseadas) Forma, porosidad, superficie,

8 En sílica

9 Fases estacionarias comerciales

10 Interacciones

11 FASES MÓVILES Dada una FS la FM controla k’ y α Fuerza eluyenteEnergía de adsorción del disolvente (en la FS) por unidad de área (de FM) A mayor valor de ε0 mayor fuerza  mayor polaridad Mezcla de solventes  valores intermedios de fuerza eluyente, pero la relación no es lineal

12 Variación de k’ y α Variación de retención Variación de selectividadCambio de proporciones Cambio de fuerza eluyente Variación de selectividad Cambio de solventes Conservación de fuerza eluyente Pruebas preliminares en capa fina

13 Fases móviles comunes

14 RETENCIÓN Alcanos < olefinas < aromáticos < haluros, sulfuros < éteres < nitroderivados < ésteres – aldehídos – cetonas < alcoholes – aminas < sulfonas < sulfóxidos < amidas < ácidos carboxílicos

15 MECANISMO DesplazamientoCompetición entre moléculas de FM y analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

16 APLICACIONES Apolares a medianamente polares Peso molecular < 5000Poco solubles en agua Generalmente complementario a reparto Amplio rango de aplicación Bueno para separar isómeros Todas las ramas de investigación

17 CROMATOGRAFÍA DE REPARTO

18 C. De reparto Desarrollada como alternativa a c. de adsorción (fácil, reproducible; mejor resolución y vida útil que adsorción Más utilizada actualmente (fases enlazadas, HPLC) Modalidades líquido-líquido y fase enlazada Fase normal o fase reversa

19 FASES ESTACIONARIAS Película de fase estacionaria líquida o pseudo- líquida unida a soporte Idealmente el soporte no interacciona Unión de FS física (c. líquido-líquido) o química (c. de fase enlazada) Sangrado de columna

20 Sangrado

21 Fases líquidas Preparación por varios métodos.Evaporación de solvente Recubrimiento directo Precipitación Recubrimiento dinámico Para fase normal: agua, formamida, glicerol, polialcoholes Para fase reversa: escualano, octanol, hidrocarburos grandes

22 Fases enlazadas Unión con enlace covalente de cadena orgánica (grupo funcional) al soporte Funcionalización de la cadena, longitud de la cadena, grado de recubrimiento del soporte Polaridad, capacidad, retención.

23 Fases enlazadas

24 Fases enlazadas

25 FASES MÓVILES De acuerdo a la polaridad de analito y fase estacionariaInfluye sobre la estructura de la fase estacionaria Sus variaciones influyen en la resolución Índice de polaridad (sol. En dioxano, nitrometano y etanol)

26 Efecto sobre FS

27 Propiedades

28 MECANISMO Basado en polaridad Polaridad analitos:Hidrocarburos < éteres < ésteres < cetonas < aldehídos < amidas < aminas < alcoholes

29 Relaciones de polaridad FS

30 Relaciones de polaridad FM

31 Variación de k’

32 Variación de α

33 APLICACIONES Tradicionalmente, analitos polares de bajo a medio peso molecular En general, mayoría de analitos, con la técnica adecuada

34 Aplicaciones

35 Ejemplos

36 CASOS ESPECIALES Derivatización C. de pares iónicosC. con fases quirales

37 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

38 C. De afinidad Mecanismo de retención basado en interacciones ESPECÍFICAS reversibles, propias de los sistemas biológicos (interacción antígeno-anticuerpo, enzima sustrato) Modelo llave-cerradura

39 FASES ESTACIONARIAS Fase estacionaria: inmobilización al soporte (unión química) de uno de los componentes de un par (ligando de afinidad) Ligandos generales y ligandos de alta especificidad Ligandos de origen natural o sintético

40 FASES ESTACIONARIAS Soporte: baja retención de analitos en general, fácil modificación (unión de ligandos), estable a condiciones de análisis Bajo rendimiento: material no rígido, de partícula grande (geles orgánicos) Alto rendimiento: rígido, partícula pequeña (sílica, vidrio, poliestireno)

41 C. De afinidad

42 FASES MÓVILES Elución por fasesInyección del analito, en presencia de FM con las condiciones adecuadas para la unión ligando- analito (composición, pH, fuerza iónica). Fase móvil débil Elución del analito en presencia de FM que los desplaza o promueve la disociación del complejo ligando-analito. Fase móvil fuerte

43 Tipos de elución Elución inespecífica Elución bioespecíficaElución bioespecífica en fase normal Elución bioespecífica en fase reversa OJO En este tipo de cromatografía fase normal y fase reversa NO se refieren a polaridad

44 Tipos de elución Normal: El buffer de elución contiene un agente que compite con el ligando por unirse con el soluto. Reversa: El buffer de elución contiene un agente que compite con el soluto por unirse con el ligando. La elución no específica, debilita el enlace.

45 MECANISMO

46 Elución bioespecífica

47 APLICACIONES Biomoléculas Moléculas con efecto biológico Células

48 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

49 C. De intercambio iónicoBasado en los equilibrios de intercambio entre los distintos iones de una solución sobre la fase estacionaria Competición entre iones de FM y de analito por adsorberse sobre los sitios activos de FS

50 FASES ESTACIONARIAS Sólido de elevada masa molecular, insoluble en FM, superficie con grupos funcionales ionizables Naturales (arcillas, zeolitas) o sintéticos (resinas)

51 Clasificación según tipo analitoIntercambiadores catiónicos Intercambiadores aniónicos

52 Clasificación según formaFases estacionarias porosas: Copolímero estireno-divinilbenceno como soporte, superficie modificada con grupos ionizables Fases estacionarias peliculares: Partículas esféricas no porosas de soporte (vidrio, polímero, sílica) con película de resina de intercambio

53 FASES MÓVILES Soluciones acuosas con o sin modificadores orgánicos (metanol) Contienen sustancias iónicas (buffer) pH controla ionización de FS  controla retención/elución Fuerza iónica controla competición contra analito  controla elución

54 MECANISMO 5.html 

55 Retención Polivalentes más que monovalentesPara grupos con la misma carga, las diferencias de retención se dan por tamaño del ión hidratado y otras propiedades

56 APLICACIONES Analitos iónicos, bajo a medio peso molecularOrgánicos e inorgánicos Fármacos, metabolitos, alimentos

57 Aplicaciones

58 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

59 C. De exclusión molecularExclusión por tamaño Basado en la capacidad de penetración de los analitos en los poros de la FE de acuerdo con su tamaño (y en menor medida con su forma)

60 FASES ESTACIONARIAS Red de poros uniforme, a manera de tamizPoca interacción con el analito (evitando otros mecanismos de retención) Partículas de sílica o poliméricas Polímeros orgánicos o inorgánicos Geles hidrofóbicos o hidrofílicos

61 Propiedades FS Tamaño promedio de poro impone límites a la separación (porosidad o grado de enrecruzamiento). Límite de exclusión: Peso molecular por encima del cual no se retienen las moléculas Límite de penetración: Peso molecular por debajo del cual hay libre penetración

62

63 FASES MÓVILES Capaz de disolver completamente los analitosEn este tipo de c. NO existe fase normal y reversa: Filtración sobre gel: rellenos hidrofílicos y solventes acuosos Penetrabilidad sobre gel: rellenos hidrofóbicos y solventes orgánicos no polares

64 MECANISMO 6.html 

65 APLICACIONES Moléculas grandes, amplio rango de polaridad BiomoléculasPolímeros

66 Aplicaciones de la C. líquida

67 MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCIÓNFin