1 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)Licda. Carol Villatoro de Santistaban Análisis Instrumental Departamento de Fisicoquímica Escuela de Química USAC

2 ¿Por qué? Cromatografía clásica Cromatografía instrumentalMás: rapidez, resolución Menos: ensanchamiento de banda  altura de plato teórico Automatización

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4 INSTRUMENTACIÓN Fase estacionaria Fase móvil Muestra ColumnaHorno Fase móvil Suministro de solventes Desgasificación Bombas Tubería Muestra Inyector Detector

5 Cromatógrafo básico

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7 Suministro de solventesSolvente libre de partículas y de gases Filtración off-line y on-line Reservorios para varios solventes Programación para mezcla de solventes

8 Suministro de solventes

9 Desgasificadores Vacío Destilación Agitación con calentamientoPurga con gas inerte

10 Programador de gradienteMezcla de solventes para gradiente Gradiente de alta presión Simple, pero caro Una bomba por solvente Volumen controlado por velocidad de bomba Gradiente de baja presión Barato Una sola bomba Volumen controlado por tiempo de apertura de válvulas

11 Programación en alta presión

12 Programación en baja presión

13 Bombas Altas presiones (>6000 psi) Libre de pulsacionesAmplio intervalo de caudal ( ml/min) Reproducibilidad Resistencia a la corrosión Tipos Recíprocas De desplazamiento Neumáticas

14 Bomba neumática

15 Bomba neumática Simple Barata Libre de impulsosVentajas Desventajas Simple Barata Libre de impulsos Primera utilizada, todavía se usa para empacar columnas Capacidad limitada Caudal depende de viscosidad y presión de retorno Presión menor a 2000 psi Sólo condiciones isocráticas Bomba neumática

16 Bomba de desplazamiento

17 Bomba de desplazamientoVentajas Desventajas Flujo independiente de viscosidad y contrapresión Libre de pulsaciones Capacidad limitada Problemática para cambio de solventes Rellenado lento Bomba de desplazamiento

18 Bomba recíproca

19 Bomba recíproca Alta presión de salidaVentajas Desventajas Alta presión de salida Adaptable fácilmente a elución con gradiente Caudal independiente de viscosidad y contrapresión Flujo pulsado Bomba recíproca

20 Recíproca de un pistón

21 Recíproca de dos pistones

22 Tubería Ensanchamiento extra columna

23 Tubería

24 Columna

25 Horno

26 Inyección Características: Volumen pequeño (<500 µL)Sistema a alta presión Problemas de reproducibilidad Variabilidad de volúmenes Vulnerabilidad a abrasión

27 Inyección

28 Inyector Septum Resistencia a alta presión (10,000 psi)Acero inoxidable Volumen fijo y constante (5 – 500 µL) Inyector de bucle

29 Inyector

30 FIN