1 CROMATOGRAFÍA Mikhail Tswett, 1906 Separación de pigmentos vegetales usando una columna de carbonato cálcico

2 CROMATOGRAFÍA Separación de los componentes de una mezcla (muestra), disueltos en una fase móvil a medida que se van desplazando con diferente velocidad a través de una fase estacionaria

3 TIPOS DE CROMATOGRAFÍASESTADO FÍSICO DE LAS FASES: Fase Móvil - Gaseosa (Cromatografía de gases) - Líquida (Cromatografía Líquida) Fase Estacionaria - Líquida (inmovilizada, soporte) - Sólida

4 TIPOS DE CROMATOGRAFÍASCRITERIOS DE SEPARACIÓN: 1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”) Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil y estacionaria en función de sus características. La composición de la fase móvil es constante ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida) Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la composición de la fase móvil para eluirlos.

5 CROMATOGRAFÍA DE REPARTOSOLUBILIDAD Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar 2. TAMAÑO (exclusión molecular) Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas separadas por una especie de tamiz o malla

6 CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓNINTERCAMBIO IÓNICO Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico 2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA Fase estacionaria hidrofóbica 3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA Fase estacionaria con ligandos inmovilizados 4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA hidroxiapatita, colorantes inmovilizados

7 TIPOS DE CROMATOGRAFíATipo de interacción/reparto Tipo de cromatografía Reparto Solubilidad Fase Normal Fase Reversa Tamaño Exclusión Molecular Interacción Electrostática Intercambio aniónico Intercambio catiónico Hidrofóbica Afinidad biológica Ligandos inmovilizados Inmunoafinidad Afinidad inespecífica Hidroxiapatita Colorantes

8 FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC)2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

9 TERMINOLOGÍA FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico) componente estático de la cromatografía FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la columna los componentes de la mezcla a analizar ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta lograr la salida de los solutos ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

10 TERMINOLOGÍA CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución. Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el eluído de una columna VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a través de la columna hasta que sale cada soluto VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil, que no experimenta ningún retraso. También se llama VOLUMEN DE EXCLUSIÓN

11 CROMATOGRAFIA EN COLUMNARegistrador Solventes (fase móvil) Bomba(s) COLUMNA Detector (UV) Mezclador Inyector Colector de fracciones

12 HPLC: High Performance Liquid Chromatography

13 Waters, Millipore

14 Perceptive BioSystems, BioCAD

15 SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS MEDIANTE HPLC

16 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA (manual)

17 SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES POR ULTRACENTRIFUGACIÓN

18 ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS MEDIANTE DIÁLISIS

19 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR

20 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULARVolumen de líquido en los intersticios (Vo) en las partículas (Vi) Volumen ocupado por la matriz (Vg) Volumen de elución (ml) 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 Absorbancia (280 nm) VT = Vo+ Vi + Vg Volumen total de líquido (Vt) Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes

21 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULARNombre comercial Tipo de matriz Rango tamaño Sephadex G-50 dextran Sephadex G-100 dextran Sephacryl S-200 HR dextran Ultrogel AcA 54 polyacrylamide/agarose Ultrogel AcA 44 polyacrylamide/agarose Ultrogel AcA 34 polyacrylamide/agarose Bio-Gel P-60 polyacrylamide Bio Gel P-150 polyacrylamide Bio-Gel P-300 polyacrylamide

22 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR: Estimación de masas molecularesMarcadores de masa molecular Recta de calibrado 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 A280 nm 25 kD 67 kD 14 kD 43 kD Volumen de elución (ml) Volumen de elución (ml) 20 40 60 80 100 120 0.0 2.0 A280 nm Proteína problema Log Mr

23 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULARVENTAJAS: Flexibilidad en cuanto a solvente Condiciones poco agresivas Proporciona información estructural INCONVENIENTES: Poco resolutiva, debido a difusión La muestra se diluye Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños Etapas finales de protocolos de purificación

24 CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR: Columnas de “desalado”0.2 0.4 0.6 0.8 1. 1.2 0.0 2.0 0.3 kD 120 kD Volumen de elución (ml) Cambio de solvente Purificación de fragmentos de DNA marcados (fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD

25 INTERCAMBIO IÓNICO

26 INTERCAMBIADORES IÓNICOSFASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO SOPORTES: RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno) - Densidad muy alta de grupos intercambiadores - Muy hidrofóbicas: desnaturalización de biomoléculas - Eliminación de impurezas iónicas de solventes químicos y de tampones Purificación de agua POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa

27 INTERCAMBIADORES IÓNICOS

28 INTERCAMBIADORES IÓNICOSTipo Grupo cargado Abreviatura De aniones Fuerte Dietil-2-hidroxipropilamino etilo QAE Débil Dietilamino etilo DEAE De cationes Sulfo propilo SP Carboxi metilo CM CH2CH3 + -CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3 CH2CH3 CH2CH3 + -CH2CH2-N-H CH2CH3 - -CH2CH2-CH2-SO3 - -CH2-COO3

29 INTERCAMBIADORES IÓNICOS+ aniónico débil (DEAE) aniónico fuerte (QAE) carga pH catiónico fuerte (SP) catiónico débil (CM) -

30 INTERCAMBIO IÓNICO K= [Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)]Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+) Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+) [Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)] K= [Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]

31 CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICOEquilibrado. Ajuste a condiciones iniciales Adsorción. Baja fuerza iónica Intercambio aniónico, pH >pI Intercambio catiónico, pH < pI Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. Elución. Modificación de la fase móvil: aumento de fuerza iónica + pH pI -

32 INTERCAMBIO IÓNICO GRADIENTE DISCONTINUO0.5 2.0 [NaCl] (M) Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Número de fracción

33 INTERCAMBIO IÓNICO GRADIENTE LINEAL0.5 2.0 [NaCl] (M) Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Número de fracción

34 CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA2.0 1.0 [Sal] (M) - - -- Absorbancia (280 nm) 0.0 0.0 20 40 60 80 100 120 Fenil-sefarosa Octil-sefarosa Número de fracción

35 CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICACapacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas (PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN- (NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+

36 FORMATO 1. COLUMNA - Sistemas manuales - Equipos automatizados (HPLC)2. “BATCH” o TANDAS 3. SUPERFICIES PLANAS - Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

37 CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS- Papel - Capa fina (TLC, thin layer chromatography)

38 CROMATOGRAFÍA EN PAPEL- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras de celulosa del papel - Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla) Cromatografía de reparto, fase normal

39 CROMATOGRAFÍA EN PAPELAplicación de la muestra: volumen mínimo Desarrollo de la cromatografía: Extremo sumergido en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de la muestra Recipiente cerrado herméticamente. Ascendente/descendente Detección de las sustancias separadas: Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes) Tinción Autorradiografía (compuestos radiactivos)

40 CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINAOptimización de cromatografía en papel Fase estacionaria: fina capa ( mm) de sólido pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o cristal. Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel

41 VENTAJAS DE LA TLC Característica Efecto VentajaFase estacionaria finamente dividida Elevada acción capilar Rapidez de desarrollo Elevada superficie de contacto f. móvil f. estacionaria Eficiencia cromatográfica Sensibilidad Ausencia de estructura fibrosa Reducida dispersión de los solutos durante aplicación y desarrollo Válida cualquier fase estacionaria que pueda ser pulverizada Versatilidad

42 MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLCAplicación Color Inespecífico Vapores de Iodo C. orgánicos Pardo-amarillento H2SO4 + calor Negro (carbonización) Específico 2,4-dinitrofenilhidracina C. carbonílicos Naranja AgNO3/OH- Marrón Ácido iodoplatínico Bases Púrpura-negro Verde de bromocresol Ácidos Verde-amarillento Ninhidrina Aminas 1rias (aminoácidos) Azul-violáceo Rodamina 6G Lípidos fluorescencia

43 FACTOR DE RETARDO (Rf) Rf = Frente del solvente solutoDistancia migrada por el soluto Rf = Distancia migrada por el frente origen

44 TLC BIDIMENSIONAL 2ª dimensión 1ª dimensión punto de aplicación

45 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD+ glucose

46 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDADEquilibrado. Ajuste a condiciones iniciales. Adsorción. Alta fuerza iónica. Lavado. Condiciones iguales a la adsorción. Elución. Competición con ligando libre Desnaturalización (pH, temperatura, agentes caotrópicos) 2.0 Adición de ligando libre Absorbancia (280 nm) 0.0 20 40 60 80 100 Número de fracción

47 LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

48 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD: PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIAActivación del soporte Anclaje covalente del ligando Bloqueo de grupos reactivos remanentes O-C-NH-ligando OH NH agarosa = C=N agarosa OH O + NH2-ligando agarosa + CNBr OH O

49 PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES

50

51 CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

52 INMUNOPRECIPITACIÓN

53 INMUNOPRECIPITACIÓN