1 Cromatografía Técnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria Volumen de columna Muestra aplicada Matriz Tapón poroso Eluyente Proteínas separadas

2 Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna)Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente y que se. Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna. Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad. Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica. Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.

3 Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gelPRINCIPIO: Separación en función del tamaño APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de proteínas TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida

4 Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gelPRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor masa molecular

5 FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 2.5 5 G50 5.0 10 G75 7.5 12-15 G100 10.0 15-20 G150 5000 – 15.0 20-30 G200 5000 – 20.0 30-40

6 Desventajas: No se pueden obtener fracciones de proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas

7 Fraccionar extractos proteicosCromatograma Detección de proteína

8 Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz

9 Ejemplo: Mezcla de proteínasConalbúmina + Feritina MW (kDa) 75 440

10 FASE ESTACIONARIA En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano. Tipo Peso molecular Límite de fraccionamiento (daltons) Agua retenida (g/g gel sec) Volumen de gel hidratado (ml/g gel seco) G10 Hasta 700 1.0 2 G15 Hasta 1500 1.5 3 G25 2.5 5 G50 5.0 10 G75 7.5 12-15 G100 10.0 15-20 G150 5000 – 15.0 20-30 G200 5000 – 20.0 30-40

11 Ejemplo: Ferritina NaCl Conalbúmina Proteína MW (kDa) Conalbúmina 75440 NaCl 0.058 Ferritina NaCl Conalbúmina

12 Ejemplo:

13 Å kDa MASA TAMAÑO