1 Cromosomas Politénicos en Drosophila virilis Biol 3030 Laboratorio de Biología del Desarrollo Universidad de Puerto Rico- Aguadilla JA Cardé, PhD

2 Objetivos  Introducir ciclo de vida y desarrollo de Drosophila  Introducir conceptos de cromosomas politénicos.  Realizar extracción de glandulas salivares de larva de Drosophila  Preparación de cromosomas politénicos para observar en microscopía de luz

3 Drosophila sp -Organismo modelo para estudio de genética clásica -Thomas Hunt Morgan -Dimorfismo sexual -Tamaño -Color y forma abdomen -Peines sexuales

4 Ciclo de vida -Organismo modelo para estudio de desarrollo -Ciclo de vida -Huevo -Embrión -Larva instar Dia 1 -Instar 2 – Dia 2 -Instar 3 – Dia 3 -Pupa 2-3 Dia 6 -Adultos Dias 9-10

5 Desarrollo

6 Cromosomas -n = 4, 2n = 8 -Par #1 sexual -Punto (X) o J (Y) -Pares #2, #3, #4 autosomales -Poseen un centrómero -Posición terminal – 1 y 4 -Forma de bastón -Posición intermedia – 2 y 3 -Forma de V -Brazos R y L

7 Cromosomas -n = 4, 2n = 8 -Par #1 sexual -Pares #2, #3, #4 autosomales -Poseen un centrómero -Posición terminal – 1 y 4 -Forma de baston -Posición intermedia – 2 y 3 -Forma de V -Posicion

8 Evidencias de Equivalencia Genómica  Cromosomas politénicos  14 celulas nodrizas de ovocitos tiene 512 copias (2n=1024)  Endomitosis: rondas repetidas de replicación sin que medie división celular o separación de cromátidas  No: diferencias estructurales entre ellos en células distintas  Si: distintos “puffed up areas” en tiempos distintos  Análisis con [ 3 H]-U  Función: transcripción masiva

9 Mapas de Cromosomas Politenicos - No: diferencias estructurales con otros cromosomas - SI: Distintos “puffed up areas” en tiempos distintos - Pulse and Chase Analysis: con [ 3 H]Uridina -Cromosomas gigantes : interfase vs metafase -PLT activos

10 Larvas del 3er instar  Dipteros tienen estos cromosomas tambien

11 Protocolo -Seleccione varias larvas grandes (3er instar, la mas gorditas que caminen, Figura 5 ), de Drosophila con una aguja de disección o pincel. -Colóquelas en una gota de solución ringer de insecto sobre una laminilla, mucho Ringer se deslizan, muy poco se deshidratan. -Sitúe la laminilla en un fondo oscuro para mejor contraste con el color blanco de la larva y sus órganos internos en el microscopio de disección -Identifique las glándulas salivares y observe su relación con otros órganos.

12 Protocolo -Coloque una aguja en la región bucal, entre los dos espiráculos y otra en la parte posterior de la larva. -Cuando tenga la larva bien pillada hale las agujas en dirección contraria. Las glándulas salivares y el tejido graso adherido a ellas permanecerá pegado a la región bucal. -Separe el debris fuera de la gota y remuévalo con una pipeta. Limpie las glándulas removiéndoles la grasa con agujas, alfileres y/o tijeras. -Fíjelas en HOAc 45%. Remueva lo mas que pueda del ringer con una pipeta y reemplácelo con el HOAc 45%. Asegúrese de que estén inmersas en el acido. Déjelas reposar por 5 minutos.

13 Protocolo -Remueva el HOAc con una pipeta y y descártelo. - Lave las glándulas de nuevo con HOAc 45% para remover partículas flotantes pero con mucho cuidado no las pierda, y no las deje secar - Tíñalas con Acetocarmine cubriéndolas completamente. Asegúrese que están inmersas en el tinte. -Caliente suavemente con hornilla pero que no se sequen !. El núcleo tardará hasta 20 min en oscurecerse. - Remueva el exceso de tinte y lave con HOAc 45%. Cuando las glándulas se vean oscuras remueva el exceso de tinte con la pipeta, cuidado no se le pierdan !. -Colóquelas en el centro de la laminilla y enjuague 2x con HOa 45%, descartando el exceso. Lo único que debe verse con color son las glándulas. No dejarlas que se sequen.

14 Protocolo  Coloque un cubre objeto sobre la glándulas primero de un lado y luego del otro evitando las burbujas.  Aplaste los cromosomas. Sujetando el cubreobjetos en su lugar desde los lados para que no se mueva apriete firmemente varias veces directo hacia abajo con la goma de un lápiz.  Esta presión explota las células, rompe los núcleos y dispersa los cromosomas. Si se dispersan bien, examine a 100x para ver si se ve algo. Si se ven como bolas de hilo necesitan mas dispersión. No los riegues moviendo el cubreobjetos porque los romperás.  Examine en el microscopio. Revise el campo en 100X para buscar cromosomas bien dispersos y tenidos con sus bandas. Cambia a 400X para buscar los mejores y luego a 1000X con aceite obsérvalos y dibújalos y/o retrátalos.

15 Protocolo  Para preservar la laminilla se puede sellar los bordes con esmalte de uñas claro. Déjelos secar completamente y rotule la laminilla.  Recuerde limpiar su microscopio correctamente!!!

16 Referencias Electrónicas  Drosophila  http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/Drosop hila.html http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/D/Drosop hila.html  http://www.ceolas.org/fly/intro.html http://www.ceolas.org/fly/intro.html  Fly Base - http://flybase.org/http://flybase.org/  Polytene Chromosomes - http://msg.ucsf.edu/sedat/polytene_chrom.html http://msg.ucsf.edu/sedat/polytene_chrom.html  Preparation - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2818712/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2818712/  http://web.as.uky.edu/biology/faculty/kellum/bio315/Lab%204A, %204B%20Exercise-Spring%202015.pdf http://web.as.uky.edu/biology/faculty/kellum/bio315/Lab%204A, %204B%20Exercise-Spring%202015.pdf  https://www.youtube.com/watch?v=OsLZ-rLLLf8 https://www.youtube.com/watch?v=OsLZ-rLLLf8