1 Cultivo de Virus y técnicas para estudiarlos.En las primeras décadas de los 1900, los virus se cultivaban en animales. El ratón y los monos eran hospederos comunes.
2 Crecimiento y propagación en huevosHuevos embrionados inoculados con virus
3 Sucesos importantes 1949 Enders, Weller & Robins : Premio Nobel Cultivaron virus en monocapas de células de tejido embrionario. 1951 Hopkins,J. : Cultiva línea celular inmortalizada de Henrietta Lacks que sufría de cáncer cervical. Creación de células HeLa.
4 Creación de línea celular
5 Cultivo en el lab En platos petri ó frascos:
6 Virus en células en medio enriquecido
7 Cultivo en diferentes líneas celularesCélula 1ria continua: tejido se segrega Ej. Fibroblastos
8 Líneas celulares Línea celular diploide W1-38 de pulmónLínea de epitelio humano ( HeLa) Línea 1ria de prepucio humano Línea de fibroblastos de ratón
9 ¿Cómo sabemos si los virus se están propagando en las células?!Una forma sería estudiando el efecto citopático! (ECP) Esto se refiere a los cambios que el virus provoca en las células. Puede ser en el núcleo ó en el citoplasma.
10 Señales de efecto citopáticoCélulas redondeadas Más espacios entre ellas Grumos y comenzar a sufrir lisis Formación de un *Sincicio * célula grande con muchos núcleos por la fusión de células
11 Ejemplos de efecto citopáticoEn Herpes: proliferación en membrana celular , vacuolas en el citoplasma y rompimiento de cromosomas en la célula que infecta En Polio: Vacuolas en el citoplasma En Picornavirus, Rhabdovirus, Adenovirus y Herpes: Redondeo y desprendimiento de las células
12 Análisis de Virus 1930 Ensayo de placas: Permite estudiar la multiplicación de bacteriófagos 1975 Dulbecco,R. Premio Nobel: los virus /animales forman placas de una manera similar.
13 Análisis cuantitativosPreguntas guías: ¿cuántos Virus? ¿cómo se miden?
14 Determinación del PFU PFU= unidades formadoras de placas# de placas X factor de dilución Ej. 17 placas X 10^6 PFU= 1.7 x 10^8
15 Cinetica de “Hits” Cinética de 1 hit= 1 partícula viral es suficiente para formar 1 placa. # de placas es proporcional directamente a la concentración del virus. Cinética de 2 hits= se necesitan 2 partículas para hacer una placa.
16 Ensayo de dilución punto finalNO siempre los virus forman placas… entonces… Se puede medir el TCID 50 : mide muerte de las células en placas de 96 pozos. Se hacen 10 monocapas de cultivos celulares y se infectan con diluciones del virus para identificar el efecto citopático en la mitad de los cultivos. En las diluciones bajas, todos los cultivos son infectados.
17 Efecto citopáticoTCID50
18 Estudio del enlace
19 Proporción partícula-PFU#de partículas virales muestra/ # de partículas infecciosas
20 Ensayos para medir partículas infecciosasHemaaglutiinación: Se mezclan eritrocitos con ciertos virus como el de la Influenza y se unen causando aglutinación. Inmunotinción: inmunofluorescencia Directa e Indirecta
21 Inmunotinción: se usan fluorocromos y microscopía de fluorescenciaDirecta: Ag viral-Abs específicos-fluorocromo Indirecta: Es más específica porque usa un 2do anticuerpo. Ag viral-Abs 1rios-Abs2rios-fluorocromo
22 Estudio de enlace
23 ELISA Para detectar proteínas virales en el sueromuestra clínica , se usan Abs contra la Proteína viral . Se acoplan a placas de 96 pozos Se añade la muestra clínica y si laproteína viral está presente, al añadir un Abs 2rio ésta se une al anticuerpo que a su vez esta conjugado a una enzima como la peroxidasa de rábano y a un sustrato.
24 ELISA: detecta Agviral ó anticuerpos
25 Enlace técnica ELISA
26 SDS-PAGE Separa las proteínas en geles de poliacrilamida
27 Western blot Si un virus infecta celulas, es posible separar las proteínas virales acopladas a anticuerpos específicos para esas proteínas en una gel de poliacrilamida con electroforesis. La gel es transferida a una membrana con afinidad a las proteínas separadas. La gel y la membrana son colocadas entre papel absorbente para transferir las proteínas a la membrana por acción capilar.
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29 Estudio de la técnica
30 Se puede incubar la membrana con anticuerpos específicos para la proteína viral conjugados a una enzima como la peroxidasa de rábano. Luego se incuba con un sustrato. Las proteínas pueden luego visualizarse con “x-rays film”
31 Variante de la técnica Podría usarse un anticuerpo primario para que se una a la proteína en la membrana y luego añadir un anticuerpo 2rio dirigido al 1er anticuerpo. Pase a ver diagrama disponible en el blog del Dr. V. Racaniello
32 Southern blot: separa DNA
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35 Southern blot.. Separa DNA basado en tamañoSe transfieren fragmemtos de DNA a gel de agarosa Fragmentos pequeños se mueven más rápido
36 PCR Técnica de Polimerasa en cadenaPermite amplificar DNA y hacer millones de copias de la molécula Ciclos: Se eleva la temperatura a 95 grados para separar cadenas o desnaturalizarlas Se baja la temperatura a 60 grados para permitir la unión de los “primers” de DNA. Lo s “primers”sirven de molde para que la Taq DNA polimerasa añada nuevas secuencias al terminal 3’.. Esto a 72 grados.
37 Productos del Final del ciclo 12 cadenas de DNA doble hélice
38 Ciclo 2 de la PCR Se repiten los pasos del ciclo 1Desnaturalización a 95 grados Unión de los primers a 65 grados Síntesis de la polimerasas a 72 grados
39 Productos al final del ciclo 24 cadenas de DNA
40 Ciclo 3 Se vuelven a repetir los ciclos anteriores6 cadenas de DNA dovle cadena con terminal 3’ siempre más largo y 2 cadenas “molde”.
41 Ciclo 4 Repetición de pasos Continúa el proceso de amplificación8 moléculas de DNA y 8 primers
42 Ciclos adicionales… Al final de 30 ciclos habrán millones de copias del DNA “target”
43 Técnicas noveles Pirosecuenciaciónse basa en controlar el flujo secuencial y cíclico de nucleótidos sobre una placa en combinación con un sistema de detección bioluminiscente que permite convertir los productos generados durante la incorporación de nucleótidos (pirofosfato) en luz (por medio de la luciferasa) que es detectable por el dispositivo CCD.