1 DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA PROYECTO DE TITULACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TITULO DE INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA “Análisis de frecuencia de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) en el gen AKT1 en pacientes con cáncer de mama del Hospital SOLCA núcleo Quito y en un grupo control de mujeres sanas.” Director: Marcelo Grijalva, Ph.D. Codirector: Javier Camacho, Ph.D. Byron Patricio Freire Paspuel SANGOLQUÍ, AGOSTO 2015
2 INTRODUCCIÓN
4 Factores de Riesgo Amplificaciones Proteínas y mutaciones AntónimasControlables Peso corporal Maternidad Consumo de anticonceptivos Lactancia Consumo de alcohol No Controlables Edad Alteraciones genéticas Origen étnico Antecedentes familiares Menarquía y menopausia Ruta Señalización Los factores de riesgo que intervienen en la aparición de cáncer de mama son…. Los defectos genéticos más comúnmente encontrados en el cáncer de seno son mutaciones esporádicas o amplificaciones en oncogenes y genes supresores de tumores. Un tipo de variante genética son los SNPs o Single Nucleotide Polimosfism, los cuales son variaciones genéticas de un solo nucleótido en el ADN, estos SNPs pueden producir cambios de aminoácido en la secuencia de la proteína que codifican, además pueden sobre-expresarla o inhibir su expresión. Estas sobre expresiones o inhibiciones pueden influir diferentes rutas de señalización de la célula como PI3K/AKT1/mTORC -American Cancer Society, 2015. -Suter et al., Biologics: Targets & Therapy.
5 PI3K/AKT/mTOR Ruta metabólica y de señalización intracelular. Estimulación mediada por factores de crecimiento. Video La ruta PI3K/AKT/mTOR es la ruta de señalización importante en la célula y responde a la disponibilidad de nutrientes y de la estimulación mediada por hormonas o factores de crecimiento, la importancia de la ruta se debe a su papel en la proliferación y el crecimiento celular. PI3K (Fosfatidilinositol 3 quinasa) responde a la ausencia o presencia de una estimulación de los receptores tirosina-quinasa (RTKs) de factores de crecimiento como EGFR, HER2, HER3 y HER4. PI3K fosforila PIP2 (Phosphatidylinositol biphosphate) convirtiéndolo en PIP3, esta fosforilación a través de PI3K puede ser inhibida por el supresor de tumores PTEN (Phosphatase and tensin homolog), la pérdida de PTEN y mutaciones en el gen PI3K son alteraciones que pueden causar cáncer de mama. PIP3 se une a los dominios homólogos a la plecstrina (PH) de Akt (protein kinase B) y PDK-1 (Phosphoinositide-depend kinase-1) y las engancha a la membrana celular. Ya en la membrana PDK-1 fosforila a Akt. La cinasa Akt monofosforilada es liberada en el citoplasma donde interactúa con mTORC2, un complejo que consta de la serina/treonina proteína cinasa mTOR, fosforila a Akt en la serina 473 y la activa completamente. La activación de Akt fosforila TSC2 con lo que inhibe TSC1/2, TSC actúa como una GTPasa que activa a Rheb, esto permite la fosforilación de PRAS40 y estimula mTORC1. mTORC1 actúa sobre el metabolismo celular y lleva a la vía de crecimiento anabólico. -Pamplomata et al., Therap Advances in Medical Oncol. -Hennessy et al., Nature Reviews Drug Discovery.
7 Justificación Mejor caracterización del tumor. Mejores diagnósticos.Posibles blancos terapéuticos. Terapias más eficaces. Caracterización de la población. ¿Para qué analizar SNPs? Primero podremos caracterizar de mejor manera al tumor y así identificar variantes genéticas que producen tumores y crear firmas genéticas. Una vez que hayamos encontrado mutaciones características podremos desarrollar mejores métodos de diagnóstico que nos puedan ayudar a detectar el cáncer en estadios mas tempranos o a clasificarlo de mejor manera. A su vez estas firmas genéticas nos sirven para desarrollar terapias más específicas hacia diferentes tipos de tumor. Se ha visto que el comportamiento del organismo hacia terapias o alteraciones genéticas en diferentes poblaciones, es por eso que se busca caracterizar a la población ecuatoriana, ya que su comportamiento puede diferir y los blancos terapéuticos pueden ser diferentes en comparación a otras poblaciones. En especial en una población tan diversa como la población ecuatoriana. Y algunos ejemplos muestran que variantes genéticas tienen comportamientos diferentes en diferentes poblaciones. -Yarden et al., Molecular Carcinogenesis.
8 OBJETIVOS
9 Objetivo General Determinar la presencia de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) en el gen AKT1 en pacientes mujeres del Hospital SOLCA núcleo Quito que padecen de cáncer de mama y en un grupo control de mujeres sanas.
10 Objetivos EspecíficosDeterminar las frecuencias alélicas y genotípicas de SNPs en el gen AKT1 en pacientes diagnosticadas con cáncer de mama y en un grupo control de mujeres sanas de la ciudad de Quito. Correlacionar la presencia de SNPs estudiados en el gen AKT1 entre el grupo control y el grupo de estudio. Analizar la asociación de los polimorfismos estudiados con las características histopatológicas e inmunohistoquímicas de la enfermedad.
11 MATERIALES Y MÉTODOS
12 Grupo Control Grupo de Casos Grupos de Estudio185 Muestras de sangre periférica Mujeres sanas sin historial de cáncer de mama o de ovario. Grupo de Casos 91 Muestras de tumor de mama fijadas en parafina Características histopatológicas.
13 Posición en la proteínaPolimorfismos SNP Cambio del alelo Posición en la proteína Cambio del residuo Función Producto Proteína Cad. E319G GAG>GGG 319 E [Glu]>G [Gly] Mutación contrasentido No-sinónima Pos P388T CCC>ACC 388 P[Pro]>T[Thr] rs GCA>GGA Intrón Desconocida rs TGC>TAC Neg
14 Extracción de ADN y PCR Microtomo Extracción PureLink PurificaciónCuantificación Nanodrop PCR Electroforesis
15 Purificaciones y SecuenciaciónPurificación AMPure PCR sec BigDye v3.1 CleanSEQ 3130 Genetic Analyzer
16 Variables y estadísticaVariables del estudio Genotipos Estadiaje del tumor Edad Metástasis Gangliolar Receptores de factores de crecimiento Lateralidad Márgenes quirúrgicos Subtipo Modelo Intrínseco Análisis estadístico Equilibrio Hardy-Weinberg Tablas de contingencia (X2) Riesgo - Odds Ratio
17 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
18 Estandarización de PCRPurificación de ADN genómico.
19 Estandarización de PCREstandarización de Temperatura de annealing Estandarización MgCl2 y ramping Ramping rápido 3ºC/s Ramping estandar 1ºC/s
20 Purificación de PCR Controles Casos Purificación de PCR por AmPure vs. PureLink PCR Purification
21 PCR y Secuenciación E319G P388T rs3803304 rs2494732 AA CC CC CG GG GGGA AA rs
22 SNPs y subtipos rs3803304 CC 31 58.5 4 36.4 15 93.8 54 59.3 Ref CG 18Genotipo Luminal A Luminal B HER2 TNBC Total Valor p n % rs CC 31 58.5 4 36.4 15 93.8 54 59.3 Ref CG 18 34.0 7 63.6 5 45.5 0.0 30 33 0.003 GG 7.5 2 18.2 1 6.3 7.7 0.29 CG+GG 22 41.5 63.7 37 40.7 0.005 rs 24 45.3 6 54.5 37.5 41 45.1 GA 36.3 9.1 8 50 0.287 AA 9.4 12.5 13 14.3 0.53 GA+AA 29 54.7 54.6 10 62.5 54.9 0.856 53 58.2 11 12.1 16 17.6 91 100
23 Frecuencia GenotípicaEquilibrio Hardy-Weinberg Existe equilibrio Hardy-Weinberg en la muestra estudiada. SNP Genotipo Frecuencia Genotípica Frecuencia Alélica HWE P Casos Controles Total rs C/C 0.59 0.65 0.63 0.76 0.82 0.80 > 0.05 C/G 0.33 G/G 0.08 0.02 0.04 0.24 0.18 0.20 rs 0.34 0.35 0.54 0.57 G/A 0.41 0.48 0.46 A/A 0.25 0.17 0.43 Zang et al., PlosOne. Wang, et al., Oral Pathology & Medicine
24 SNPs e Histopatología rs3803304 rs2494732 Variables CC CG+GG GG GA+AALateralidad Derecha 28 (30.77) 24 (26.37) Izquierda 26 (28.57 ) 13 (14.29) 17 (18.68) 22 (24.18) P 0.22 0.81 Estadio tumoral T0-X 3 (3.3) 2 (2,20) 1 (1,10) T1-T2 43 (47.25) 27 (29.67) 32 (35.16) 38 (41.76) T3-T4 8 (8.79) 10 (10.99 ) 7 (7.69) 11 (12.08) P value 0.43 0.65 Met. nodular + 29 (31.87) 18 (19.78) 22 (24.17) 25 (27.47) - 19 (20.88) 0.636 0.728 ER 33 (36.26) 26 (28.57) 21 (23.07) 11 (12.09) 15 (16.48) 0.369 0.797 PgR 31 (34.07) 30 (32.97) 23 (25.27) 16 (17.58) 20 (21.97) 0.475 0.92 HER2 12 (13.19) 11 (8,79) 16 (20,88) 42 (46.15) 30 (25,27) 34 (45,06) 0.06 0.591
25 SNPs y Riesgo de Cáncer * * *Genotipo Casos (n=91), n (%) Controles (n=185), (%) OR (IC 95%) p rs CCa 54 (59) 121 (65) Referencia CG 30 (33) 61 (33) 1.1 ( ) 0.832 GG 7 (8) 3 (2) 5.2 ( ) 0.027 CG + GG 37 (41) 64 (35) 1.3 ( ) 0.395 rs GGa 41 (45) 56 (30) GA 89 (48) 0.56 ( ) 0.063 AA 13 (14) 40 (22) 0.44 ( ) 0.047 GA + AA 50 (55) 129 (70) 0.52 ( ) 0.022 * * * Hildebrandt et al., Clinical Oncology. -Kim et al., Surgical Oncology. Pu et al., Lung Cancer. -Li et al., Clinical Cancer Res.
26 SNPs y Corte y Empalme Predicción de la influencia de las variante intrónicas rs y rs sobre el los lugares de corte y empalme: INTRÓN 13 EXÓN
27 CONCLUSIONES
28 CONCLUSIONES El genotipo CG del SNP rs está relacionado a una disminución de casos TNBC. La presencia la variante rara del SNP rs (GA+AA), puede reducir el riesgo de desarrollar cáncer de mama a la mitad. El genotipo raro GG del SNP rs puede aumentar el riesgo de desarrollar cáncer de mama en cinco veces. Los SNPs E319G y P388T no son relevantes en el desarrollo de cáncer de seno en Ecuador.
29 CONCLUSIONES Los SNPs presentes en intrones pueden estar relacionados al desarrollo de cáncer de mama. El gen AKT1 es relevante en el desarrollo de cáncer en la población ecuatoriana. La presencia de SNPs puede estar relacionada al desarrollo de un subtipo de cáncer de mama. Los SNPs estudiados tienen diferente influencia entre diferentes poblaciones.
30 RECOMENDACIONES
31 RECOMENDACIONES Evaluar el ADN extraído de tumores fijados en parafina. Comprobar la presencia de variantes genéticas raras de los SNPs de interés en bases de datos como dbSNP o 1000 Genomes. Analizar la distribución bimodal del cáncer de mama en función de la edad en la población ecuatoriana. Emplear varios programas predictivos antes de entrar en la fase experimental de la identificación de polimorfismos. Analizar la expresión del gen AKT1 en casos de cáncer de mama.
32 Proyecto Cóndores STR B7 STR H115 Fw Rv Rv Fw
33 Proyecto Cóndores STR A20 SVG9 SVG10 SVG16
34 Proyecto Cóndores H269
35 Concentración Inicial Volumen Final de ReacciónSugerencias Reactivo Concentración Inicial Concentración Final Volumen X 1 (uL) Agua MQ 1.50 BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 0,5 BigDye Terminator Sequencing Buffer 5X 0.75 X 0.9 Primer Fw/Rv 1 uM 0,27 uM 1,6 ADN amplificado 1,5 3 Volumen Final de Reacción 6 Purificar productos de PCR con columnas. Agregar mayor cantidad de producto purificado en MM de secuenciación. Eluir las perlas magnéticas con centrifugación da mejores resultados en muestras problema.
36 Protocolos Estandarización AMPure, PCRsec y CLeanSeq a mitad de volumen. Puridficación de Snapshots con CleanSEQ Inventario enzimas de restricción: 51 tubos de enzimas.
37 Proyección Distribución bimodal del cáncer de mama.
38 AGRADECIMIENTO Andrés López Carolina Salazar Germán BurgosMarcelo Grijalva Javier Camacho César Paz y Miño
39 GRACIAS