1 Diagnóstico de LaboratorioEnfermedad de Chagas Diagnóstico de Laboratorio Dr. Guillermo G. Nuñez Inmunoserología y Autoinmunidad

2 amastigote trypomastigote ESTADIOS EVOLUTIVOS T. cruzi epimastigote

3 Ciclo heteroxénico

4 Mecanismos de InfecciónVECTORIAL TRANSPLACENTARIA TRANSFUSIONAL TRANSPLANTES

5 ETAPA AGUDA Curso clínico Signo de Romaña Fiebre Hepato/esplenomegaliaPeríodo de incubación: ~7 días  Generalmente asintomática  Primoinfección en niños de zonas endémicas Signo de Romaña Fiebre Hepato/esplenomegalia Encefalitis  Forma sintomática 40-60 *Alta parasitemia

6 ETAPA LATENTE *Período de 30-40 años*Equilibrio entre la patología parasitaria y la respuesta inmune *Asintomático Inmunidad Concomitante *Baja parasitemia *Alta producción de Anticuerpos

7 DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO

8 Infección Aguda Infección Crónica clínica clínica InfecciónIntensidad de respuesta Anti-T.cruzi IgM Período incubación Anti-T.cruzi IgG parasitemia Infección 1-2 semanas semanas

9 TRATAMIENTO ETIOLOGICOInfección Aguda Infección Crónica clínica TRATAMIENTO ETIOLOGICO Anti-T.cruzi IgG parasitemia Intensidad de respuesta Transmisión vectorial Transmisión congénita Período incubación VER NOTAS Infección 1-2 semanas semanas >1 año años

10 Fase aguda -ReactivacionesMETODOS PARASITÓLOGICOS Fase aguda -Reactivaciones Xenodiagnóstico Microhematocrito Hemocultivo Strout Sensibilidad 100% // PARASITOS VIVOS-MUESTRA FRESCA Xeno y HEMO amplifican CONDICIONES DE TOMA DE MUESTRA

11 Tripomastigote sanguíneo –(May-Grünwald-Giemsa)

12 METODOS SEROLÓGICOS Antígenos solubles de membrana y citoplasmáticosEtapas latente y crónica – Screening bancos de sangre HAI Antígenos solubles de membrana y citoplasmáticos ELISA Antígenos recombinantes (SAPA) IFI Epimastigotes enteros MACHADO GUERREIRO –NO !!!!!!!!!! METODOS DE INTERACCION PRIMARIA Y SECUNDARIA

13 Sensibilidad analíticaHemaglutinación Indirecta (HAI) IgGAM Económico Sensibilidad analítica NO automatizable

14 Sensibilidad analíticaEnzimoinmunoensayo (ELISA) IgG IgM Económico Sensibilidad analítica Automatizable Reproducible

15 Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)IgG IgM Requiere microscopía de fluorescencia Sensibilidad analítica Reproducible

16

17 Inmunoensayo quimioluminiscente (CMIA) CMIAAntígenos recombinantes

18 conjugado muestra TcF-FP3 FP6-FP10 h. H2O2 Micropartículas-Ags

19 Requiere tecnología y experienciaReacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es la amplificación enzimática de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias de oligonucleótidos que hibridan en la cadena complementaria de la molécula molde que se va a amplificar (cebadores o “primer”) y que son utilizados por una DNA polimerasa termoresistente para copiar la secuencia de la misma. kDNA o sDNA costosa Requiere tecnología y experiencia Sensible y específica No dependiente de Estado Inmunitario desnaturalización extensión hibridización

20 PCR convencional PCR En Tiempo Realextracción ADN total nucleótidos dATP, dGTP, dCTP, dTTP Taq DNA-polimerasa F primers R PCR convencional PCR En Tiempo Real

21 Ciclado (Amplificación)Desnaturalización Ciclado (Amplificación) 56°C Alineamiento 72°C Elongación

22 Schijman et al. PLoS Negl Trop Dis. 2011 Enero; 5(1): 931

23 Técnica de diagnóstico Formas clínicas de la Enfermedad de ChagasAGUDA LATENTE-CRÓNICA CONGÉNITA GOTA FRESCA + - GOTA GRUESA ++ MICROCONCENTRACION +++ STROUT HEMOCULTIVO -/+ XENODIAGNÓSTICO PCR ++++ SEROLOGÍA (inicio) + (>20 días) IgG materna<6 meses IgM niño

24 Algoritmo diagnósticoANTECEDENTE EPIDEMIOLOGICO -Transmisión vectorial -Transfusión sanguínea -Transmisión congénita -Trasplante de órganos INFECCION POCO PROBABLE no si SINTOMÁTICO ASINTOMÁTICO FORMA AGUDA Búsqueda de tripanosomas en sangre Métodos parasitológicos: Xenodiagnóstico-Strout-Microhematocrito Hemocultivo -PCR (-) FORMA CRONICA Búsqueda de Anticuerpos Métodos Serológicos: HAI-ELISA-IFI Acs totales-IgG-IgM (-) DIAGNOSTICO IMPROBABLE (+) dos tests (-) Xenodiagnóstico PCR Seguimiento clínico (+) DIAGNÓSTICO CONFIRMADO

25 IgG >basal IgG ≤basal CONFIRMA CASO (tratamiento) NO CONFIRMA CASOGESTANTE CHAGÁSICA RECIEN NACIDO BUSQUEDA DEL PARÁSITO -Microconcentración -PCR BUSQUEDA DE ANTICUERPOS (IgG) -ELISA -IFI (titulación del suero) CONTROL SEROLÓGICO A LOS 3, 6 y 9 meses -ELISA -IFI (titulación del suero) IgG >basal IgG ≤basal CONFIRMA CASO (tratamiento) NO CONFIRMA CASO

26 El problema de Inmunorreactividad Cruzada…

27 Enfermedad de Chagas Leishmaniosis

28 Familia Trypanosomatidae ANTÍGENOS COMPARTIDOSTrypanosoma cruzi (tripomastigotes) Leishmania spp (promastigotes) Familia Trypanosomatidae ANTÍGENOS COMPARTIDOS

29 LABORATORIO CLÍNICA DIAGNÓSTICO DE CERTEZA

30 Muchas gracias