1 Diseño de bacterias para inmobilización de metales: Bio-remediación de suelos Marc Valls y Víctor de Lorenzo

2 Ca, Mg, Fe Mn, Cu, Co, Zn Pb, Cd, Ni, Ag, Hg Abundancia Toxicidad

3 Mecanismos de toxicidad de los metales pesados - Permeabilización de membranas. - Interferencia en la homeóstasis del Ca. - Efectos sobre la estructura del DNA. - Alteración de las funciones de los metales esenciales.

4 Río Guadiamar el día después del accidente de Aznalcóllar

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6 Bacterias para la bioremediación de metales pesados?

7 NANOMICROMILIMOLAR 110100110100110100110 METALES ORGANISMOS Eucariotas Cianobacterias Metalotioneínas

8 Metalotioneína-2 de rata

9 MDPNCSCSTGGSCTCTSSCACKNCKCTSCKKSCCSCCPVGCSKCAQGCVCKGAADKCTCCA SGKGK GE K C TS A CRS EP C QC GS K C Q C G EG CT CAAC K T C NC TSDGC K C G K E CTGPDSC K CG S SCSCK MPGPCCNDKCVCQEGGCKAGCQCTSCRCSPCQKCTSGCKCATKEECSKTCTKPCSCCPK MPDVKCVC C KEGKE C ACF GQ DC CK TGECCK D GTCC G IC TNAAC K C A NG C KCG S G C S C TEGNC AC MPCPCGSGCKCASQATKGSCNCGSDCKCGGDKKSACGCSE VCKCDCKNQNCSCNTGTKDCDCSDAKCCEQYCCPTASEKKCCKSGCAGGCKCANCECAQAAH KVNNNCCCGENAKPCCTDPNSGCCCVSETNNCCKSDKKECCTGTGEGCKCTGCKCCQPAKSGCCCGDKAKACCTDPNSG CCCSSKTNKCCDSTNKTECKTCECCK GDCGCSGASSCNCGSGCSCSNCGSK ANDCKCPNGCSCPNCANGGCQCGDKCECKKQSCHGCGEQCKCGSHGSSCHGSCGCGDKCECK PEQVNCQYDCHCSNCACENTCNCCAKPACACTNSASNECSCQTCKCQTCKC MEFTTAMFGTSLIFTTSTQSKHNLVNNCCCSSSTSESSMPASCACTKCGCKTCKC MFSELINFQNEGHECQCQCGSCKNNEQCQKSCSCPTGCNSDDKCPCGNKSEETKKSCCSGK MTVKICDCEGECCKDSCHCGSTCLPSCSGGEKCKCDHSTGSPQCKSCGEKCKCETTCTCEKSKCNCEKC TSTTLVKCACEPCLCNVDPSKAIDRNGLYYCSEACADGHTGGSKGCGHTGCNCHG MSGCGCGSSCNCGDSCKCNKRSSGLSYSEMETTETVILGVGPAKIQFEGAEMSAASEDGGCKCGDNCTCDPCNCK 1- Mouse 2- Snail 3- Crab 5- Drosophila 4- Sea urchin 9- Candida 6- C. elegans 7- Tetrahymena 8- Neurospora 15- Pea 11- Yarrowia 12- Saccharomyces 14- Cianobacteria 10- Candida 13- Saccharomyces

10 MT CdMT Cd 2+ CdMT MT CdAlb. Alb. Cd 2+ CdMT Cd 2+ Hígado Intestino, pulmones Riñón

11 NANOMICROMILIMOLAR 110100110100110100110 METALES ORGANISMOS Eucariotas Cianobacterias Metalotioneínas Gram-positivas Quimiolitótrofos E. coli Alcaligenes sp. Exportación, reducción Gram-negativas

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13 Sistemas de expresión de metalotioneínas en la superficie de E. coli

14 Envuelta de gram-negativas Membrana externa Membrana interna Peptidoglicano Espacio periplásmico

15 1. OM 1. Lpp-OmpA-MT OM 2. 2. LamB-MT OM Peptidoglicano 4. 4. MT-PAL 3. MT-IgAb 3.

16 IgA proteasa de Neisseria Periplasma Citoplasma ME MI

17 E-TagMT IgA  LeaderPlac Periplasma medio C M 2+

18 Fraccionamiento de E. coli pMt  wt MIME wtDsba - Soluble KDa 97.4 200 66.2 45.0 31.0 Dsba -

19 Localización de MT-IgA  en E. coli MIMESoluble KDa 97.4 200 66.2 45.0 31.0 wt Dsba -

20 ELISA sobre células 1 Intacta 3 Lisada 2 Choque osmótico Y Y Y Y Y Y Y Y Y Superficie Superficie + periplasma Proteína total

21 Exposición en la superficie 3 0 1 2 DO 492 EstirpeWTDsba - WT + pMt  + 2- Superficie + periplasma 3- Proteína total 1- Superficie -

22 Bioacumulación de Cd 2+ en E. coli nmoles Cd 2+ /mg 0 5 10 15 + Estirpe pMt  WTDsba - WT + -

23 Problemas - Las cepas de laboratorio son inadecuadas. - Se requiere selección para mantener los genes - E. coli es sensible a los metales. - Inducción con IPTG Soluciones - Usar bacterias resistentes a metales. - Usar estirpes del suelo. - Integrar los genes en el cromosoma. - Inducir con aromáticos.

24 Expresión de metalotioneínas en bacterias del suelo (Ralstonia eutropha)

25 Estructura del transposón Tn5-MT  IO XylSKmPm MT  1 Kb

26 Transposición de TnMT  Escherichia coli Ralstonia sp. Pseudomonas sp.

27 Ralstonia sp. Pseudomonas sp. Transposición de TnMT 

28 Expresión de MT-IgA  en R. eutropha KDa 55.0 66.2 40.0 42.7 30.1 TnMT  3-MB + + - + + - + + - + - -

29 Localización de MT-IgA  en R. eutropha KDa 97.4 55.0 66.2 42.7 40.0 ++ MIMESol. TnMT  MIMESol.MIMESol. -

30 30  M 0 15 30 + nmoles Cd 2+ /mg 0 15 30 + E. coli MT  R. eutropha 300  M 0 15 30 45 + - --

31 Ralstonia eutropha MT 

32 Nice but… does it work in polluted soil?

33 Inmobilización de Cd 2+ en el suelo Suelo estéril +Ralstonia wt +Ralstonia MT 321

34 321

35 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Estéril +Cd 2+ WT +Cd 2+ MT +Cd 2+ Control (sin Cd 2+ ) 15 Peso seco (g) Clorofila (mg/g) Efecto de R. eutropha sobre el crecimiento vegetal

36 Inmobilización de Cd 2+ en suelo 1- Suelo estéril 2- + Ralstonia wt 3- + Ralstonia MT 321