1 DNA RECOMBINANTE E INGIENIERÍAGENÉTICA

2 INGENIERÍA GENÉTICA MANIPULACIÓN DEL DNA DE LOS ORGANISMOS VIVOS1) INVESTIGACIÓN BÁSICA (ESTUDIO DE LA ORGANIZACIÓN, EXPRESIÓN Y FUNCIÓN DE GENES EN LOS ORGANISMOS VIVOS). 2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓN CONSCIENTE DE LOS GENES EN SALUD, EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS, EN LA AGRICULTURA, ETC.

3 PIEDRAS ANGULARES DE LAINGIENIERÍA GENÉTICA CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNA Y GENÓMICAS DESCUBRIMEINTO DE LAS ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (ENZIMAS DE RESTRICCIÓN) DESCUBRIMIENTO DE LA REACCIÓN DE POLIMERIZACIÓN DE CADENA O PCR (POLYMERASE CHAIN REACCTION)

4 Técnicas de DNA Recombinante

5 El problema: ¿Qué material genético vamosa manipular y cómo lo vamos a hacer?

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7 ANALISIS DE GENES TECNICAS Obtener múltiples copias de ellosAislar secuencias de DNA Obtener múltiples copias de ellos TECNICAS Clonamiento Molecular PCR (reacción en cadena de la polimerasa) Se requiere:

8 CLONAMIENTO MOLECULARHERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped *

9 Enzimas de Restricción

10 DIGESTION DEL DNA POR ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIONSitio de corte

11 Sitios de corte de endonucleasas de restricciónSitio de corte de enzimas de restricción Sitios de corte de endonucleasas de restricción ES ENZIMAS de RESTRICCION Las flechas indican los enlaces fosfodiester sobre los que actúa cada enzima

12 CLONAMIENTO MOLECULARHERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped

13 Características básicas de un vector de clonamientoOrigen de replicación autónomo Gen marcador de selección Sitios únicos de restricción

14 Caja de clonaje múltipleComponentes básicos de un vector de clonamiento plasmidial que puede replicar en una célula de E.coli codifica proteína de resistencia a ampicilina Región de inserción de DNA Exógeno Origen de replicación Caja de clonaje múltiple

15 ¿PORQUE EL USO DE UN VECTOR ?1ª división celular 2ª división celular

16 TIPOS DE VECTORES kpb Plasmidios 3-5 bacteriofagos 15 BACS 300inserto Plasmidios bacteriofagos BACS YACS

17 CLONAMIENTO EN PLASMIDIOEcoRI PvuII Sitio de corte Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII

18 CLONAMIENTO MOLECULARHERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped

19 Fragmentos de DNA genómicoUnión de fragmentos de restricción que poseen extremos cohesivos Fragmentos de DNA genómico b c

20 CLONAMIENTO EN PLASMIDIOEcoRI PvuII Sitio de corte Extremos cohesivos Extremos romos Vector plasmidial cortado con EcoR1 y PvuII DNA cromosomal cortado con EcoR1 y PvuII

21 CLONAMIENTO MOLECULARHERRAMIENTAS BASICAS Enzimas de restricción Vectores DNA ligasa Células huésped

22 PROPAGACION EN CELULA HUESPED

23 RESUMEN DE CLONAMIENTOEnzimas de restricción DNA Ligasa Vector Célula huésped

24 CLONES que contienen diferentes fragmentos del genoma = GENOTECA

25 GENOTECAS O LIBRERÍAS CONSTRUCCIÓN DE LIBRERÍAS DE cDNAY DE DNA GENÓMICO USO DE VECTORES -PLASMIDIOS -DNAs DE FAGOS -OTROS (BACs, COSMIDIOS, YACs, ETC).

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27 Genoteca de cDNA Obtención : Clonamiento de cDNA obtenido mediantetranscripción reversa de mRNA total.

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32 vectores + ligación transformación

33 Genoteca de DNA genómicoObtención : 1. Fragmentación de todo el genoma mediante enzimas de restricción 2. Clonamiento de fragmentos en vectores

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35 ¿Cómo aislar un fragmento de DNA de interés?Aislamiento de un clon -Uso de sondas radiactivas - PCR

36 HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADASIdentificación de un fragmento de DNA específico en las colonias transformadas mediante HIBRIDIZACION CON SONDAS MARCADAS

37 Clonamiento por PCR

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39 CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCRlibreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

40 Combinación de la transcripción reversa con PCRRT-PCR

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42 Cloning by RT-PCR TTTTTTT PCR cDNA Corte con enzimas de restricción y ligación a un plasmidio

43 CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCRlibreria CLONAMIENTO DE UN PRODUCTO DE PCR

44 SECUENCIACION DEL DNA

45 Estudio de la función de un genVectores de expresión

46 Vector de expresión en bacterias

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48 Vectores de expresión en eucariotes

49 FUNCIÓN DE UN GEN Herramientas de Estudio:Análisis computacional en banco de datos: homología de secuencia con un gen de otro organismo cuya función se conoce. Animales transgénicos y knock out.