1 Identificación y análisis funcional de microRNAs desregulados en cáncer mamaDr. César López Camarillo Laboratorio de Oncogenómica y Proteómica del Cáncer Las glándulas mamarias son órganos característicos de los mamíferos encargados de producir leche . Son glándulas exocrinas formadas por lobulillos que se agrupan formando lóbulos, donde se produce la leche que es transportada al pezón a través de ductos. EL pezón por donde emerge la leche se encuentra rodeado por una areola y por debajo de la epidermis y rodeando a la glándula hay tejido de sostén constituido por tejido adiposo y conectivo fibroso. En un 80 % de los casos de CM las neoplasias son ductales y el resto son lobulillares . La unidad ductal lobular terminal de la mama (TDLU) normal consiste en un epitelio de dos capas de células luminales y mioepiteliales. La transformación de las células epiteliales de la mama para dar lugar finalmente al CM metastásico se da por una amalgama de cambios genéticos, epigenéticos e interacciones aberrantes dentro del microambiente. Durante este proceso con múltiples etapas, se desregula el control de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración, dándose interacciones aberrantes entre las células tumorales con las células del estroma que facilitan este proceso. El CM puede iniciar como una lesión premaligna conocida como hiperplasia atípica ductal (ADH) donde se encuentran células intraluminarles anormales. Se piensa que las lesiones ADH son precursora del carcinima ductal in situ (DCIS), que son lesiónes no invasivas que contiene células anormales proliferando dentro del ducto . En cada etapa, el riesgo de desarrollo maligno o CM invasivo (IBC) aumenta. DCIS puede dar lugar a IBC, pero no está claro cómo predecir cual va a ser la progresión de las lesiones. Una vez que las células han invadido, el riesgo de desarrollar metástasis aumenta significativamente. Para formar metástasis, las células deben atravesar la membrana basal, entrar en la vasculatura (intravasarse), sobrevivir a la falta de adherencia, extravasarse y establecer un nuevo tumor en un microambiente extraño. Los ganglios linfáticos son el principal sitio de metástasis del CM P C OSGRADO EN IENCIAS G ENÓMICAS 1

2 L a secuencia del genoma humano se conoce desde febrero de 2001James Watson 3,200 millones de bases (3200 Mb) Predice unos 20, ,000 genes (1.5% genoma !) 70% está compuesto por ADN extra-génico no codificante (DNA basura - microRNAs) Craig Venter

3 Each of us has variations in the DNA sequence of our genome, making us unique individuals. These variations look like this. Point to the nucleotides that vary. This individual has a G in this position of her genome, while this individual has an A in the same place. But you can also see that in most other positions they share the exact same nucleotides. Optional: Let’s take a closer look at DNA sequence variations. Open the Making SNPs Make Sense animation on the next slide.

4 Examples of People Who Have had Their Genomes SequencedOzzy Osbourne Jim Watson Craig Ventor James Watson Craig Venter From: sciencewithmoxie.blogspot.com.au/2010_11_01_archive.html

5 Transcript-oma (mRNA)ACGTTATGAGACGGATTAGGACAAACTATAAAAATATTAGCCGATGATCACCCAGGATTTTT Transcript-oma (mRNA) Prote-oma (Proteínas) Gen-oma (DNA) El Dogma Central de la Biología Molecular y los “omas” MicroRN-oma (miRNAs)

6 siRNAs, lncRNA, microRNAsmicroRNAs: nuevos reguladores de la expresión genética Transcritos RNAs no codificantes RNAm que codifican proteínas RNAs reguladores de la expresión génica RNAs de mantenimiento tRNA, rRNA, snRNA snoRNAs siRNAs, lncRNA, microRNAs MicroRNAs: RNA pequeños (21-25 nt) que regulan negativamente la expresión genética. Descritos en 1993 por Victor Ambros en C. elegans. Un microRNA puede modular hasta mas de 100 transcritos y proteínas diferentes Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 6

7 Los microRNAs son reguladores negativos de la expresión génicaExisten mas de miRNAs codificados en el genoma humano. Se desconoce la función de mas del 80% de los miRNAs. Gen miRNA mi Los genes que codifican a los microRNAs (>1000) se localizan dispersos en el genoma. Se unen a la región 3´UTR de los RNAm (transcritos) e inhiben su traducción e inducen su degradación MicroRNA Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Degradación del RNAm Silenciamiento de la expresion génica 7

8 OncomiRs: microRNAs que funcionan como oncogenes y supresores de tumorUn microRNA funciona como oncogén cuando inhibe genes que suprimen la proliferación, crecimiento tumoral, metástasis, o que activan apoptosis miR-21 PDCD4 Apoptosis Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Cáncer 8

9 Los microRNAs modulan los hallmarks del cáncerAutosuficiencia de las señales de crecimiento Insensibilidad a las señales de anti-crecimiento Potencial replicativo ilimitado Invasión de tejidos y metástasis Angiogénesis Evasión de la apoptosis Las glándulas mamarias son órganos característicos de los mamíferos encargados de producir leche . Son glándulas exocrinas formadas por lobulillos que se agrupan formando lóbulos, donde se produce la leche que es transportada al pezón a través de ductos. EL pezón por donde emerge la leche se encuentra rodeado por una areola y por debajo de la epidermis y rodeando a la glándula hay tejido de sostén constituido por tejido adiposo y conectivo fibroso. En un 80 % de los casos de CM las neoplasias son ductales y el resto son lobulillares . La unidad ductal lobular terminal de la mama (TDLU) normal consiste en un epitelio de dos capas de células luminales y mioepiteliales. La transformación de las células epiteliales de la mama para dar lugar finalmente al CM metastásico se da por una amalgama de cambios genéticos, epigenéticos e interacciones aberrantes dentro del microambiente. Durante este proceso con múltiples etapas, se desregula el control de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración, dándose interacciones aberrantes entre las células tumorales con las células del estroma que facilitan este proceso. El CM puede iniciar como una lesión premaligna conocida como hiperplasia atípica ductal (ADH) donde se encuentran células intraluminarles anormales. Se piensa que las lesiones ADH son precursora del carcinima ductal in situ (DCIS), que son lesiónes no invasivas que contiene células anormales proliferando dentro del ducto . En cada etapa, el riesgo de desarrollo maligno o CM invasivo (IBC) aumenta. DCIS puede dar lugar a IBC, pero no está claro cómo predecir cual va a ser la progresión de las lesiones. Una vez que las células han invadido, el riesgo de desarrollar metástasis aumenta significativamente. Para formar metástasis, las células deben atravesar la membrana basal, entrar en la vasculatura (intravasarse), sobrevivir a la falta de adherencia, extravasarse y establecer un nuevo tumor en un microambiente extraño. Los ganglios linfáticos son el principal sitio de metástasis del CM 9

10 Los microRNAs representan nuevos blancos terapéuticos en cáncerLas glándulas mamarias son órganos característicos de los mamíferos encargados de producir leche . Son glándulas exocrinas formadas por lobulillos que se agrupan formando lóbulos, donde se produce la leche que es transportada al pezón a través de ductos. EL pezón por donde emerge la leche se encuentra rodeado por una areola y por debajo de la epidermis y rodeando a la glándula hay tejido de sostén constituido por tejido adiposo y conectivo fibroso. En un 80 % de los casos de CM las neoplasias son ductales y el resto son lobulillares . La unidad ductal lobular terminal de la mama (TDLU) normal consiste en un epitelio de dos capas de células luminales y mioepiteliales. La transformación de las células epiteliales de la mama para dar lugar finalmente al CM metastásico se da por una amalgama de cambios genéticos, epigenéticos e interacciones aberrantes dentro del microambiente. Durante este proceso con múltiples etapas, se desregula el control de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración, dándose interacciones aberrantes entre las células tumorales con las células del estroma que facilitan este proceso. El CM puede iniciar como una lesión premaligna conocida como hiperplasia atípica ductal (ADH) donde se encuentran células intraluminarles anormales. Se piensa que las lesiones ADH son precursora del carcinima ductal in situ (DCIS), que son lesiónes no invasivas que contiene células anormales proliferando dentro del ducto . En cada etapa, el riesgo de desarrollo maligno o CM invasivo (IBC) aumenta. DCIS puede dar lugar a IBC, pero no está claro cómo predecir cual va a ser la progresión de las lesiones. Una vez que las células han invadido, el riesgo de desarrollar metástasis aumenta significativamente. Para formar metástasis, las células deben atravesar la membrana basal, entrar en la vasculatura (intravasarse), sobrevivir a la falta de adherencia, extravasarse y establecer un nuevo tumor en un microambiente extraño. Los ganglios linfáticos son el principal sitio de metástasis del CM 10

11 La expresión de los miRNAs se altera frecuentemente y contribuye a la carcinogénesis Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 11

12 Cáncer de mama Crecimiento exacerbado de los tejidos de la mama debido al aumento en la proliferación migración e invasión celular, así como la inhibición de la apoptosis . Es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres. Una muerte por cáncer de mama cada 2 h. (80%) (10%) Las glándulas mamarias son órganos característicos de los mamíferos encargados de producir leche . Son glándulas exocrinas formadas por lobulillos que se agrupan formando lóbulos, donde se produce la leche que es transportada al pezón a través de ductos. EL pezón por donde emerge la leche se encuentra rodeado por una areola y por debajo de la epidermis y rodeando a la glándula hay tejido de sostén constituido por tejido adiposo y conectivo fibroso. En un 80 % de los casos de CM las neoplasias son ductales y el resto son lobulillares . La unidad ductal lobular terminal de la mama (TDLU) normal consiste en un epitelio de dos capas de células luminales y mioepiteliales. La transformación de las células epiteliales de la mama para dar lugar finalmente al CM metastásico se da por una amalgama de cambios genéticos, epigenéticos e interacciones aberrantes dentro del microambiente. Durante este proceso con múltiples etapas, se desregula el control de la proliferación, la supervivencia, la diferenciación y la migración, dándose interacciones aberrantes entre las células tumorales con las células del estroma que facilitan este proceso. El CM puede iniciar como una lesión premaligna conocida como hiperplasia atípica ductal (ADH) donde se encuentran células intraluminarles anormales. Se piensa que las lesiones ADH son precursora del carcinima ductal in situ (DCIS), que son lesiónes no invasivas que contiene células anormales proliferando dentro del ducto . En cada etapa, el riesgo de desarrollo maligno o CM invasivo (IBC) aumenta. DCIS puede dar lugar a IBC, pero no está claro cómo predecir cual va a ser la progresión de las lesiones. Una vez que las células han invadido, el riesgo de desarrollar metástasis aumenta significativamente. Para formar metástasis, las células deben atravesar la membrana basal, entrar en la vasculatura (intravasarse), sobrevivir a la falta de adherencia, extravasarse y establecer un nuevo tumor en un microambiente extraño. Los ganglios linfáticos son el principal sitio de metástasis del CM 12

13 Genómica integrativa (omics) en el descubrimiento de biomarcadores en cáncerTumour, serum Diferentially expressed onco-proteins Protemics Protein quantification (2DE) Protein identification (MS/MS) normal tumoral normal tumoral Transcriptomics DNA microarray RNA seq Differentially expressed omcogenic mRNA/miRNA microRNAs profiling miRNAs microarrays qRT-PCR arrays (TLDA) Concordant protein/mRNA/miRNA expression (Regulatory networks) Biomarker candidates Validate proteins, mRNAs Microarray tissues (IEQ) Validation in patients Prognostic markers Functional analysis Therapeutic targets

14 Congelación en N2 almacenamiento a -80°CBúsqueda de microRNAs desregulados en cáncer de mama Cirugía Sueros Biopsias Congelación en N2 almacenamiento a -80°C Inmunohistoquímica ER, PR, HER2 Banco de tejidos FUCAM

15 Megaplex Primers TaqMan Low Density Arrays (TLDA)667 microRNAs cuantificados en un solo paso 20 miRNAs sobrexpresados (37%) 34 miRNAs reprimidos (63%) 54 miRNAs modulados (FC ≥2.0 p=0.05) Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 15

16 Huella de expresión de 54 miRNAS y validación de TLDAsLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 16

17 MicroRNAs seleccionados para análisis funcionalmiRNA Reportes Función Procesos y rutas celulares Blancos predichos miR-944 ↓ (9/9) Sobre-expresado en cáncer de cérvix Induce migración Vía de señalización WNT Vía de señalización de TGF-b Glioma, Cáncer colorectal APC, AMOT, DLL4, IGF1R, JAG1, MAPK1, NF1, NEXN, PTP4A1, TAC1 THBS1, VEGFA, miR-204 En cancer de mama, cancer endmetrial, glioma Reprime migración y metástasis ARID5B, BTG1, CD2AP, POU3F2, POU4F1, SIX4, miR-18b ↑ (9/9) Reprimido en cáncer de prostata. . Regulación negativa del receptor HER2 MAPK Biosíntesis de glicanos Uniones adherentes Señalización Fc epsilon R1 HIF1A, IGF1, MAP3K1, PARD6B, KIT Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 17

18 Análisis funcional del miR-204 en cáncer de mamaLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. M. en C. Ali Flores Pérez, UACM 18

19 La expresión del miR-204 se reprime en tumores y líneas celulares de cáncer de mamaLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 19

20 ¿Genes regulados por el miR-204?Transfección del precursor miR-204 Supresión de los transcritos blanco de miR-204 Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Transcritos modulados por el miR-204 (DNA microarrays) 20

21 No transfected controlDNA microarrays Nimbelgen 12x135 (Roche) miR-944 transfected No transfected control 135,000 probes 3 probes per gene 45,032 genes Oligos 60-mer Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 549 modulated genes by miR-204(FC≥2.0) 311 suppressed genes 238 upregulated genes 21

22 Procesos celulares en los que participan los genes modulados por el miR-204Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 22

23 Supresión de los transcritos blanco de miR-204¿ La restauración de la expresión del miR-204 modula los hallmarks del cáncer ? Supresión de los transcritos blanco de miR-204 Análisis de fenotipos: migración, invasión, proliferación, angiogénesis Transfección del miR-204 Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 23

24 El miR-204 inhibe migración de las células tumoralesScratch/wound healing assays Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Transwell assays Inserto Membrana 24

25 El miR-204 inhibe la proliferación celularLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Clonogenic assays 25

26 El miR-204 reprime genes involucrados en angiogénesisLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 26

27 Agentes pro-angiogénicos anti-angiogénicos VEGFA Angiopoyetina 2ANGPT1 Trombospondina FGF (α y β) Interleucina 4, 12 y 18 TNF-α, interfereron α,β,γ MMPs (2 y 9) Troponina-1 Angiogenina e Angiostatina IL8 TGFβ/TGFBR Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 27

28 El miR-204 inhibe la angiogénesis in vitroCo-culture angiogenesis assays HUVEC/MDA-MB-231 MDA-MB-231 HUVEC HUVEC/VEGFA HUVEC/MDA-MB-231 miR-204 HUVEC/MDA-MB-231-Sc Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are cells derived from the endothelium of veins from the umbilical cord. They are used for the study of the function and pathology of endothelial cells and angiogenesis. 28

29 ¿ El miR-204 inhibe la angiogénesis a través de la represión del mRNA de los genes pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 ? 3´UTR of miR-204 target miR-204 In abscence of miR-204 3´UTR LUC assay 3´UTR ANGPT1 miR-204 Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 29

30 El miR-204 se une a la región 3´UTR y reprime la expresión de ANGPT1 y TGFBR2Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 30

31 El miR-204 inhibe proliferación y la migración de la célula tumoral.CONCLUSIONES: Identificamos nuevos microRNAs desregulados en cáncer de mama de pacientes mexicanas El miR-204 inhibe proliferación y la migración de la célula tumoral. El miR-204 inhibe angiogénesis a través de la unión directa y desregulación del mRNA de los factores pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 La restauración del miR-204 en tumores de pacientes podría considerarse como una estrategia útil en la terapia del cáncer de mama Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 31

32 Colaboradores Financiamiento Dr. Sergio Rodríguez CuevasDra. Verónica Bautista Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM Dr. Alfredo Hidalgo Miranda Instituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN Dra. Elena Arechaga Ocampo Dr. José Díaz Chávez Dra. Erika Ruiz Garcia Instituto Nacional de Cancerología, InCan Dra. Laurence Annie Marchat Programa en Biomedicina Molecular, ENMyH-IPN Dra. Ángeles Carlos-Reyes Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Dr. Patricio Gariglio CINVESTAV-IPN Estadio 0 Carcinoma in situ, sin afectación de los ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO I: Tumor inferior o igual a 2 cm, sin afectación de los ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIA: Tumor inferior o igual a 2 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor entre 2 y 5 cm, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIB: Tumor entre 2 y 5 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIA: Sin evidencia de tumor primario, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor entre 2 y 5 cm, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIB: Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIC: Tumor de cualquier tamaño, afectación infraclavicular, o de la arteria mamaria interna con afectación simultánea axilar, o afectación supraclavicular independiente de la afectación de la arteria mamaria interna, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IV: Tumor de cualquier tamaño, cualquier afectación ganglionar, con metástasis a distancia. La inmunohistoquímica es una técnica que permite averiguar características propias de cada tumor que diferencian el cáncer de mama que sufre una mujer del que sufre otra. Se observa el tumor al microscopio y se tiñen las células con diferentes sustancias. Esto permite ver diferentes moléculas importantes que decidirán el tipo de tratamiento que podemos administrar. Entre ellas están los receptores de estrógeno y el HER2. Estos datos nos muestran que el CM representa una fuerte carga social y economica, por lo que es necesario implementar medidas encaminadas en la deteccion del CM en etapas tempranas q incluyan mastografias generalizadas y el uso d enuevos maracdores moleculares de etapas tempranas. Esto tendria un beneficio en las pacientes pues aumentaria su esperanza de vida, y disminuiria los costos de atencion por individuo. Fonsec Salud Fonsec Salud Ciencia Básica Financiamiento

33 Gracias por su atenciónSe aceptan estudiantes de Maestría y Doctorado en Ciencias Genómicas !! Estadio 0 Carcinoma in situ, sin afectación de los ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO I: Tumor inferior o igual a 2 cm, sin afectación de los ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIA: Tumor inferior o igual a 2 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor entre 2 y 5 cm, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIB: Tumor entre 2 y 5 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIA: Sin evidencia de tumor primario, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor entre 2 y 5 cm, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor de más de 5 cm, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIB: Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, sin afectación de ganglios linfáticos regionales, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, afectación ganglionar axilar no adheridos a planos profundos, sin evidencia de metástasis a distancia. Tumor que infiltra directamente la pared torácica, la piel, ambas o carcinoma inflamatorio, mazacote ganglionar o fijo a planos profundos o afectación clínica de la cadena mamaria interna en ausencia de afectación axilar, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IIIC: Tumor de cualquier tamaño, afectación infraclavicular, o de la arteria mamaria interna con afectación simultánea axilar, o afectación supraclavicular independiente de la afectación de la arteria mamaria interna, sin evidencia de metástasis a distancia. ESTADIO IV: Tumor de cualquier tamaño, cualquier afectación ganglionar, con metástasis a distancia. La inmunohistoquímica es una técnica que permite averiguar características propias de cada tumor que diferencian el cáncer de mama que sufre una mujer del que sufre otra. Se observa el tumor al microscopio y se tiñen las células con diferentes sustancias. Esto permite ver diferentes moléculas importantes que decidirán el tipo de tratamiento que podemos administrar. Entre ellas están los receptores de estrógeno y el HER2. Estos datos nos muestran que el CM representa una fuerte carga social y economica, por lo que es necesario implementar medidas encaminadas en la deteccion del CM en etapas tempranas q incluyan mastografias generalizadas y el uso d enuevos maracdores moleculares de etapas tempranas. Esto tendria un beneficio en las pacientes pues aumentaria su esperanza de vida, y disminuiria los costos de atencion por individuo. Gracias por su atención

34 (variables biológicas)Instituto Nacional del Cáncer Entendiendo al Cáncer y Temas Relacionados Entendiendo al Diagnóstico Molecular Biomarcadores tumorales en la clasificación y tratamiento del cáncer de mama ER HER2 PR Inmunohistoquímica Variables clínicas pronósticas Tamaño tumor Nódulos Metástasis Marcadores tumorales (variables biológicas) Receptor de estrógenos (ER) progesterona (PR) y HER2 Terapia hormonal Tamoxifeno (anti-ER) Ablación ovárica Anastrozol, Letrozol Quimioterapia Terapia personalizada Trastuzumab (anti-HER2) Luminal A (50%) Triple negativo (15-20%) HER2 (30%) ER+, PR+, HER2+/- ER+, PR+, HER2+++ ER-, PR-, HER2- Antes de que existiera el diagnóstico molecular, los clínicos clasificaban a las células cancerosas de acuerdo con su patología, es decir, de acuerdo con su apariencia bajo el microscopio. Posteriormente se ocuparon elementos adicionales a la clasificación molecular como la presencia/ausencia de uno o mas receptores (un receptor es una proteina que se encuentra en la membrana celular y que se encarga de recibir el estimulo hormonal). Esto es importante ya que actualmente se pueden emplear estos para tratar algunos tipos de cancer de mama, sin embargo sigue siendo insuficienta. La estructura del dominio de unión de ligandos de ambas isoformas del receptor ER ha sido totalmente dilucidada, lo que permite explicar las interacciones que tienen lugar entre agonistas, agonistas parciales, moduladores selectivos y antiestrógenos esteroídicos (antagonistas puros) y, lo que es más importante, diseñar nuevos fármacos que actúen selectivamente. Aunque los detalles conformacionales del dominio de unión de ligandos (que han sido determinados mediante análisis cristalográficos de los receptores con sus ligandos) superan el objetivo de esta revisión, diremos que este dominio está formado por 12 hélices situadas en tres capas antiparalelas y que la orientación de la hélice 12 (*) es crucial para que se unan uno u otro ligando. Además, los avances realizados en los últimos años en la dilucidación del mecanismo de acción de los receptores estrogénicos han permite descubrir inhibidores del receptor estrogénico que NO se unen al mismo en el dominio de unión de ligandos. En efecto, los diferentes estados conformacionales adoptados por el ER en presencia de diferentes ligandos influyen directamente sobre la actividad transcripcional regulando la unión a esta parte de la molécula de cofactores e indirectamente modulando la estabilidad del receptor. Se han identificado péptidos capaces de actuar sobre las interacciones receptor-cofactor, capaces de inhibir la actividad transcripcional del receptor. Esta posibilidad de interaccionar fuera del dominio de unión de ligandos también explicaría la resistencia al tamoxifeno que se observa después de un tratamiento prolongado. En este caso, se formaría en la región del dominio de unión de ligandos un nueva cavidad que permitiría el reclutamiento de los cofactores, incluso estando fijado el tamoxifeno al receptor, lo que hace que el antiestrógeno se transforme en estrógeno en lo que respecta a la respuesta celular. La importancia de este descubrimiento es obvia, ya que permite el diseño de fármacos que eviten la formación de esta cavidad de resistencia en la superficie del receptor. La acumulación de conocimientos sobre la estructura y función de los receptores estrogénicos conseguida en los últimos años, ha permitido el diseño de cientos de compuestos que interfieren con ellos. Algunos de los más importantes, varios de ellos ya conocidos, son NCI Web site: 34

35 microRNAs sobreexpresadosLa expresión de 54 miRNAs se moduló significativamente en 9 tumores mamarios ductales 54 miRNAs se desregularon en los tumores mamarios microRNAs reprimidos miR-139-5p miR-508-3p miR-10b* miR-944 miR-486-5p miR-100 miR-424* miR-125b-2* miR-218 miR-541 miR-221* miR-337-3p miR-369-3p miR-1 miR-26b* miR-95 miR-204 miR-216b miR-656 miR-488 miR-139-3p Let-7b miR-543 miR-335 miR-433 miR-489 miR-132* miR-195 miR-376c Let-7c miR-432 miR-132 miR-376a miR-10b microRNAs sobreexpresados miR-155 miR-331-3p Let-7g* miR-188-5p miR-708 miR-301a miR-454* miR-7 miR-130b miR-18b miR-183* miR-181a* miR-21 miR-142-3p miR-592 miR-425* miR-431 miR-142-5p miR-148b* miR-638 Los genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. 35

36 Los microRNAs regulan de manera negativa la expresión génicaLos genes que codifican a los miRNAs se localizan en regiones diferentes del genoma y su transcripción puede estar regulada independientemente por promotores específicos como en el caso de miR-132a. Sin embargo, la mayoría de los precursores de miRNAs están presentes en intrones y tienen la misma orientación que el gen en el que se encuentran, por lo que son co-transcritos como parte del RNAm. En algunos casos, los miRNA se traslapan o están integrados con exones de los transcritos, sin embargo en estos casos, están siempre en la misma orientación y se pueden encontrar también en las regiones no-codificantes 5′- o 3′-UTRs. El resto de los miRNAs se encuentran dentro de regiones intergénicas en clusters codificados como un transcrito policistrónico. La RNA pol II sintetiza transcritos policistrónicos denominados miRNA primario (pri-miRNA), los cuales pueden contener uno o varios miRNAs que son procesados a miRNAs individuales. Los pri-mRNAs poseen CAP, poliA) y estructuras de tallo-burbuja y horquillas que son cortadas por la endonucleasa Drosha y la proteína DGCR8, generando un miRNA precursor (pre-miRNA) de nt . El 3´del pre-miRNA contiene una horquilla con 2 nt colgantes y es exportado al citoplasma por la exportina 5 y Ran-GTP. En el citoplasma, el loop terminal del 3’ pre-miRNA es cortado por DICER y la proteína TRBP produciendo un miRNA dúplex (miRNA:miRNA*) imperfecto de nt. Posteriormente, TRBP recluta la proteína AGO2 al complejo miRNA:miRNA*-DICER, formando el complejo mínimo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Slo una de las cadenas del dúplex miRNA:miRNA* sirver como guía para dirigir el complejo RISC a la región 3´UTR del RNAm blanco, la cadena pasajera (miRNA*) es degradada por AGO2. Cuando el miRNA posee una complementariedad de bases casi exacta con su secuencia blanco, el RNAm es degradado. Cuando el miRNA tiene complementariedad parcial con su secuencia blanco, el RNAm no es cortado, pero se genera un silenciamiento traduccional, así como una disminución en la estabilidad del RNAm mediado por mecanismos ligados al secuestro de los complejos en los P-bodies. López-Camarillo C., et al 2013 36