1 Uso Racional y Manejo Integrado de Biológicos y Antibióticos en Granjas Comerciales de TilapiasDr. Jorge Martínez Aguayo Médico Veterinario Schering Plough Aquaculture

2 Tópicos Introducción Antecedentes GeneralesQuimioterápicos y Antimicrobianos Biológicos Consideraciones finales

3 Introducción Factores que afectan el rendimiento productivo:- ambientales -metabólicos -infecciosos

4 Control según etiologíaVirus: Vacunas Inmunomoduladores Bacterias: Antibióticos Parásitos: Antiparasitarios externos e internos

5 Quimioterápicos y Antimicrobianos de uso en Acuicultura: Diversos Estudios

6 Antecedentes La Farmacocinética y la deplesión dependen de:- Factores de la droga - Factores del pez - Otros

7 Antecedentes (2) I- Droga o producto farmacéutico:- Ingrediente activo: Síntesis de la droga, formas quirales - formulación: -Tipos de excipientes - manufactura - Tamaño de partículas - Manufactura de la droga, excipientes y en conjunto.

8 Antecedentes (3) II- Pez: - funcionalidad branquial, hepática y renal.- Especie - Genética - Peso - estado sanitario III.-Ambiente: - T°, O2, Salinidad

9 Drogas - Amoxicilina - Ac. Oxolínico - Flumequina - Sarafloxacino- Oxitetraciclina - Florfenicol

10 Amoxicilina B-lactámico Gram (+) y (-)Dosis: mg/kg por días Presentación comercial: 50% MIC V. anguillarum: 0,04-0,08 ug/ml MIC Pasteurella piscicida0,04-0,08 ug/ml Concentración plasmática: 1 ug/ml

11 Amoxicilina (2) F oral: 0,33% en peces. En mamíferos: 60-70%Baja distribución tisular Rápida eliminación Indicaciones: terapia contra RTFS, Vibrio y Aeromona. 95 % antibiogramas sensibles F. psychrophylum

12 Amoxicilina (3) Ensayo Ensayo: T° 22° C; 32%o dosis: I.V= 40 mg/kgoral= 80 mg/kg Conc. En alimento 8 g/kg En la diapositiva siguiente I y II corresponden a la técnicas de detección de residuos.

13 Amoxicilina (4)

14 Solubilidad Quinolonas

15 Acido Oxolínico Quinolona, derivada del Acido NalidíxicoAnillo pirimidínico Una de las primeras quinolonas Menor difusión en tejidos en comparación a otras quinolonas. La metabolización es la misma vía en SW y FW Metabolitos se excretan por la bilis Metabolización por conjugación con ácido glucorónico

16 Acido Oxolínico Estudio N°1Determinación de deplesión de OA, usando dosis de 20 mg/kg IV en FW y SW Metabolización es similar en agua dulce y agua de mar. Cambia la tasa de excreción (función renal)

17 Concentración de OA

18 Concentración de OA

19 Acido Oxolínico Estudio N°2Estudio de Biodisponibilidad Dosis oral única: dos grupos en agua de mar Experimento 1 (T1) y experimento 2 (T2) Salares Post-administración alimento medicado Salinidad: 25‰ T1: mg/kg ° w= 1108 g 1g/kg T2: mg/kg 7,5° w= g 5g/kg

20 Acido Oxolínico Estudio N°2T1: 9 mg/kg ; 9°C Cmax: 1,7 ug/ml Tmax: 10,8 hrs T2: 26 mg/kg ; 7,5°C Cmax: 2,1 ug/ml Tmax: 24,3 hrs Resultado: La biodisponibilidad del OA disminuye al aumentar la dosis. Con producto micronizado aumenta a 50%

21 Acido Oxolínico Estudio N°2

22 Acido Oxolínico Estudio N°2

23 Acido Oxolínico Estudio N°2

24 Acido Oxolínico Estudio N°3Comparación de biodisponibilidad y deplesión entre OA y UB. Salares: w = 425 g; Temperatura= 5 °C, 30‰ OA Cmáx: 0,99 ug/ ml; 25 mg /kg (oral) UB Cmáx: 2,26 ug/ ml; 25 mg /kg (oral) F(%): OA (25 mg/kg)= 40% OA( 50 mg/kg)= 25% UB (25 mg/kg)= 40-45%

25 Acido Oxolínico Estudio N°3

26 Acido Oxolínico Estudio N°3

27 Flumequina Quinolona 2a generación Altamente liposoluble BactericidaIngreso a través de MC y canales específicos Eliminación: riñón y branquia 90% Eliminación por vía digestiva: 10% Circulación enterohepática

28 Flumequina Toxicidad: mg/kg, sin signos externos. No mortalidad Truchas : hasta 150 veces la dosis terapéutica (10 mg/kg) LD50: 1077 mg/kg

29 Flumequina Ensayo en FW, para demostrar que la deplesión es termodependiente. Truchas 498 gr promedio Temperatura de 3°C y 13°C Inyección IV única de 4,9 mg/kg

30 Flumequina Ensayo N°1

31 Flumequina Ensayo N°1

32 Sarafloxacino Varian entre 0,0025-0,3 Aryl-fluoroquinolona MIC’ s:Aeromona salmonicida Vibrio salmonicida Vibrio anguillarum Yersinia ruckerii Varian entre 0,0025-0,3

33 Concentración plasmática SFX y MIC

34 Concentración plasmática SFX y MIC

35 Sarafloxacino Estudio N°1: Salares; T° 8,5 ° C. W = 163 g Dosis 10 mg/kg. Administración IV y oral C max: 0,08 -0,7 ug/ml F(%): 3,6% a 23,9%

36 Concentración plasmática SFX diferentes formulaciones Estudio N°1Parámetros Farmacocinéticos

37 Concentración plasmática SFX diferentes formulaciones Estudio N°1

38 Concentración plasmática SFX diferentes formulaciones Estudio N°1

39 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2 Salmo salar SW Temperatura 10°C W = 240 g

40 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2 1.- Adm. Oral: OA y UB: 25 mg/kg SFX y ENRO: 10 mg/kg 2.- Adm. I.V: Determinación en suero usando HPLC-Fluorescencia

41 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2

42 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2

43 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2

44 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N°2

45 Conc. plasmática de quinolonas en salares a diferente tiempo post-administración oral e iv Estudio N° 2 Parámetros Farmacocinéticos

46 Oxitetracilina Dosis 75-120 mg/kg por 15 a 21 díasRTFS: 300 mg/kg por 21 días Inmunosupresión: mecanismo no claro. Posible inhibición de mitosis. Cmax: 1,8-1,9 ug/ml en plasma 3,2 ug/ml en suero MIC para SRS: ug/ml

47 Enrofloxacino Quinolona de 3a generaciónBuena distribución en los tejidos Atraviesa BHE 15 mg/kg Desventajas Metabolización en ciprofloxacino (Salud Humana) Período de resguardo largo

48 Concentración plasmática Enrofloxacino

49 Concentración plasmática Enrofloxacino

50 Oxitetracilina 1.- Ensayo en Chinook: SW 75 mg/kg 21 días 9°Cw= 55 gramos

51 Concentración (ug/ml) OTC Chinook post.tratamiento

52 Deplesión OTC

53 Oxitetraciclina OTC alcanza conc. similares a los 9° y 15°CLos residuos de OTC en músculo caen bajo el LOD de 0,05 ug/g a los días 41 y 65 días post tratamiento a las temperaturas de 15°C y 9°C

54 Resumen BiodisponibilidadAmoxicilina : 2% Sarafloxacino : 2 % Oxitetraciclina : 3% (6-8%) Ac. Oxolínico : 25% Flumequina : 45% Enrofloxacino : 56% Florfenicol : 97%

55 Florfenicol

56 Contenidos Aquafen Antecedentes Mecanismo de acción CinéticaToxicología Eficacia Medio Ambiente y Regulatoria

57 Mecanismo de Acción Antecedentes Acción bactericidaAmplio espectro: Gram (+) y Gram (-) Amplio margen de seguridad Mecanismo de Acción Inhibición de la síntesis de proteínas bacterianas por acoplamiento a la sub-unidad ribosomal 50s

58 CLORAMFENICOL OH-CH2OH O C- C- N-C-CHOL2 O2N H- H- HEl grupo Nitro es responsable de inhibir la síntesis proteica en células de la médula osea de humanos y otros mamíferos.

59 Molécula

60 Cinética Absorción Distribución Metabolismo Excreción

61 Cinética Estudios de cinética en varias especiesRatas presentan un metabolismo similar a los salmónidos; A, D, M y E. Absorción intestinal con un 96% Buena difusión en tejidos. Concentraciones máximas alcanzadas a las 12 hrs después de la dosis administrada.

62 Cinética Concentraciones máximas alcanzadas de FFC en músculo sobrepasan las CMI registradas para la mayoría de las bacterias patógenas. Máx. concentración : 6 a 12 hrs después dosis final. Clearence termodependiente. Residuos más bajos en músculo que en piel

63 Cinética Llega a todos los tejidos (grasa, piel y cerebro)No se acumula en piel Atraviesa BHE Estudios hechos con dosis única de 10 mg/kg A mayor dosis, la Cmax alcanzada es mayor. Concentraciones séricas alcanzadas post-administración de 10 mg/kg vía oral varía de 4,0 a 9,1 ug/ml

64 Concentración plasmática de Florfenicol

65

66

67

68 2004 Cod (Gadus murhua) W= 65+ 12 g T° 12 + 0,5° C SW: 33%0Vía per. os. Vibrio sp. Cod. Bergen, Noruega. Dosis: Acido Oxolínico: 10 & 20 mg/kg FFC : 10 &20 mg/kg

69 2004 Cod (Gadus murhua) MIC para Vibrio FFC : 0,5 ug/g OXO: 0,016 ug/g

70 Mortalidad Mortalidad Dosis OXO FFC Control 10 mg/kg 34% 31% 87,5%28% 20%

71 Farmacocinética Plasma Músculo FFC (mg/l) (mg/kg) 10 mg /kg 24 hrs5,0 + 1,6 4,6 + 0,9 20 mg/kg 6,8 + 1,3 7,0 + 2,7 OXO 10 mg/kg 0,8 + 0,2 1,9 + 0,4 1,4 + 0,6 3,4 + 1,1

72 Gourami & Koi

73 2005 Koi & Gourami 1.- Koi: Cyprinus carpio W= 144+ 44 g2.- Three spot o Gourami: Trichogaster trichopterus W= g T° 24-25° C pH: 7,8-8,0 O2: 6-8 ul/L NH4+: 0,8 mg/L NO2 : 0,04 mg/L

74 2005 Koi & Gourami Koi: Cyprinus carpioThree spot o Gourami: Trichogaster trichopterus Vía IM y per os. Dosis oral ambas especies: 50 mg/kg Dosis I.M ambas especies : 25 mg/kg Universidad de Florida

75 Koi & Gourami Vía Oral Intramuscular Especie Koi Gourami Cmáx12,3 ug/ml 2,6 ug/ml 18 ug/ml 28 ug/ml Tmáx 3,0 5,0 25,0 Dosis 50 mg/kg 25 mg/kg

76 Toxicología DL50: >2.000 mg/kg Oral e IP. (en ratas)El metabolismo de FFC en el salmón es cuantitativamente similar al metabolismo en ratas. No presenta problemas de palatabilidad ni reacción adversa o conducta clínica anormal aún administrando 10 veces la dosis.

77 Toxicología Se probaron dosis 10, 50 y 100 mg/kg. Las 2 últimas alternando 10 días de medicación y 10 días sin medicar (33 días de alimento medicado). Se evaluó mortalidad y cambios histológicos en branquias, riñón e hígado. Resultado: No hay efecto en conducta, mortalidad ni cambios histológicos.

78 Impacto ambiental Estudios de FFC y metabolitos FotólisisBiodegradación aeróbica: realizada por bacterias presentes en el ambiente acuático. Vida media: 5 días.

79 Impacto ambiental Fotólisis a pH 5 a 7: la droga no se degrada en presencia de luz natural. A pH 9 la vida media de FFC se determinó en 94 días. (Metabolitos: alcohol y ácido oxámico: 3 a 6 semanas a los distintos pH señalados. FFC amina: 6 a 7semanas. Mayor efecto con bacterias en ambiente acuático.

80 Eficacia Eficacia sobre Gram (+) y Gram (-)MIC obtenidos en bacterias intracelulares (R. salmoninarum y P. salmonis). MIC obtenidos en bacterias extracelulares Gram (-) (V. salmonicida; V. anguillarum; Aeromona salmonicida; Yersinia, Flavobacterium). Gram (+): Streptococcus.

81 Antibiogramas Resultados

82 Antibiogramas Aeromona hydrophila

83 Antibiogramas Streptococcus phocae

84 Concentración Inhibitoria MínimaAgua de Mar

85 Eficacia Aquafen SRS

86 Eficacia Streptococcus

87 Eficacia Vibrio

88 Eficacia Aeromona

89 Parámetros farmacocinéticos otros antibióticos

90 Concentración sérica y CMI SRS

91 Concentración sérica y CMI Streptococcus

92 Eficacia Acido Oxolínico SRS

93 Eficacia Flumequina SRS

94 Eficacia Oxitetraciclina SRS

95 Eficacia Sarafloxacino SRS

96 Conclusiones FlorfenicolFFC y metabolitos no afecta el ambiente acuático. Droga segura al dosificarlo. No presenta problemas de apetencia. Las concentraciones alcanzadas en sangre y músculo son mayores a las MIC de la mayoría de los agentes bacterianos patógenos.

97 Comentarios QuimioterápicosAnálisis de los productos: ingrediente activo, naturaleza de los excipientes, formulación y proceso de manufactura. Análisis de los alimentos: procesos. Análisis del medio Análisis de los peces Análisis del agente: CIM-CMB Evaluación del tratamiento: cinética y depleción.

98 Uso de Biológicos en Acuicultura

99 Inmunoprofilaxis Inmunoestimulantes y/o Inmunomoduladores Vacunas

100 Modo de Acción de diferentes Tipos de InmunomoduladoresLevamisol MOS - Peptoglycans T-cell - Muramyl dipeptide Ergosan B-cell - Endotoxins (gram -) - Zymosan - Glucans - Dextran sulfate - Lentinane macrophage

101 ERGOSAN Inmunomodulador Ac. Algínico y Alginatos-PolisacáridosAlgas: Laminaria y Ascophyllum - estimula los mecanismos inmunes no-especificos. - relación con mecanismos más específicos - da protección no-especifica contra un sinnúmero de enfermedades - respuesta de corto plazo - dosis y tiempo son importantes

102 Mecanismos de Respuesta Inmuneintruder macrophage mast cell AG-AB macrophage eats antigen-antibody-complex T-cell macrophage presents antigen to T-cell plasma cell HISTAMINE B-cell INTERLEUKIN suppressor T-cell ? Immune response of course is a bit more complicated. It always starts with an intruder, an antigen, which may be a virus, a bacteriumum or anything which is strange to the body. This intruder is presented by a phagocytic cell like macrophages, Langerhans cells or dentritic cells to a T-cell. Now several ways are open: In one case specific B-cells are informed, which transform to antibody producing plasma cells. Antigen and antibodies form a complex, which can be digested by macrophages or (in a second way) reacts with mast cells. These mast cells release histamine and start the inflammation process. The second possibility is via interleukins - either to non-specific natural killer cells, which can destroy the intruder or to specific helper T-cells that inform specific killer T-cells, which destroy the antigen. another less understood way is the formation of suppressor T-cells. They can suppress immune response in cases when this is necessary like during pregnancy (because the embryo is half-strange). helper T-cell natural killer cell killer T-cell intruder destroyed intruder destroyed

103 Como trabaja Ergosan? ACTIVIDAD ALGINICAOxygen activated lymphocyte Better performance O2 ACTIVIDAD ALGINICA Aumenta el ingreso de Oxígeno y transferencia a través de la membrana celular → capacita a las células a realizar su rol más eficientemente

104 Ergosan-immunomodulatorCómo trabaja Ergosan? Sin Ergosan-immunomodulator Con helper cell memory cell antigen Killer cell B-Lymphocyte T-Lymphocyte cytotoxicity plasma cell antibodies immunomodulator

105 Enfermedad Branquial Nodular (NGD) – Peces “Calidad & Crecimiento”Ensayo en Chinook salmon (O. tschawytscha) Dirigido por King Salmon (NZ) Regimen del Ensayo – Tres Ergosan & tres control: Raceways ( – por <1g) Peces alimentados por % incorporación (2 pulsos con 25 días) Grupos separados en la mitad del ensayo en 6 estanques. Datos recolectados – Mortalidad, Peso, FCR Peces graduados y ensayo finalizado

106 Mortalidad pre-división

107 Mortalidad post-división

108 Enfermedad Branquial Nodular (NGD) – Peces “Calidad & Crecimiento”Pre - División Post - División Mort (%) Peso (g) F.C.R (Mean) ERGOSAN 1.6 6.3 0.79 0.05 11.8 0.89 CONTROL 2.1 5.1 0.90 0.15 9.5 0.98 • “Graduación” % “Grande” % “Chicos” % Descarte” ERGOSAN 34 35 32 CONTROL 20 31 49

109 White Spot (I. multifiliis) – Ensayo de InfecciónEnsayo en Estanques en Truchas Dirigido por Universidad de Stirling Régimen del Ensayo Peces alimentados por % incorporación Peces control agregados Desafío Infección Conteo de Parásitos

110 White Spot (I. multifiliis) – Ensayo de Infección• Resultados Término de la infección No. PARASITOS ERGOSAN 400.4 ± 108.5 CONTROL 537.5 ± 101.7

111 Piscicultura Salmón Atlántico N= 240.000 T1: Ergosan T2: ControlErgosan: Wi 8,32 g+ 3,9 (CV 44%) Control : Wi 8,50 g+ 3,9 (CV 42%) Diferencia 2,1 % No significativo 3 réplicas cada uno.

112 Peso promedio

113 Peso promedio Ergosan: Wf 22,22 g+ 6,18 (CV 30%)Control : Wf 19,11 g+ 5,54 (CV 32%) Diferencia 14 % Diferencias significativa

114 Mortalidad

115 Mortalidad Mortalidad Acumulada Ergosan; 12,21 % Control : 11,38 %No significativa Diferencia: 6,8% Causas infecciosas: Saprolegnia parasitica; IPNv y Flavobacterium psychrophylum

116 FCR

117 FCR Ergosan: 1,75 (Acumulada) Control : 2,68 (Acumulada)35% diferencia No diferencia estadística.

118 SGR

119 SGR Ergosan: 0,44 (Acumulada) Control : 0,33 (Acumulada)25% diferencia No diferencia estadística.

120 Conclusiones - Enfermedades bacterianas, virales, fúngicas y parasitarias. Uso en varias especies: - truchas - salmón atlántico - sea bass - camarones - tilapias - seriola Cualquier etapa productiva Producto orgánico GRAS Período de retiro: no tiene

121 APLICACIÓN DE VACUNAS a) inmersión: a.1) baño a.2) diping b) OralVías de aplicación: a) inmersión: a.1) baño a.2) diping b) Oral c) Inyección

122 Inmersión ERM (Yersinia) SalmonesGarvetil (Streptococcus/Lactococcus) Tilapia Vibrio (Vibrio) Furovac 5 (Aeromona)

123 Oral ERM (Yersinia) Garvetil (Streptococcus/Lactococcus) TilapiaVibrio (Vibrio) Furovac 5 (Aeromona): Salmónidos, Turbot, Sea bass, ciprínidos IPN: Salmones Vibromax: camarones

124 Inyección Furovac 5: Salmones y CiprínidosVibrio : salmones, Turbot, Cod, halibut, Sea bass IPN: Salmones

125 Resultados Vacunas Comerciales

126 Vibromax Vacuna inactivada 5 cepas de Vibrios:Vibrio anguillarum biotipo I Vibrio anguillarum biotipo II Vibrio harveyii Vibrio vulnificus Vibrio parahaemolyticus Administración oral 10 días 1 litro: Post-larvas. A partir de PL 4

127 Vibromax Vehículo Protección Antigénico BioencapsulaciónEnsayo de Laboratorio Ensayos de campo 3 réplicas y 3 control

128 Vibromax

129 Vibromax

130 Vibromax

131 Vibromax

132 Garvetil Vacuna inactivada - Lactococcus garviae - Streptococcus iniaePresentación inmersión y oral. Inmersión: 1 lt /100 kg biomasa Oral: lt/

133 Ensayo A Alevines 1 g 100.000 peces vacunados 100.000 peces control5 réplicas por tratamiento c/u Vacuna inmersión Transferencia al Lago Taal, Filipinas, 4 días después de la vacunación. Mortalidad acumulada 84 días después de la vacunación. RPS= 80,2%

134 Ensayo A

135 Ensayo B Alevines 2 g 40.000 peces con vacuna. 40.000 peces control2 tratamientos, 5 réplicas (c/u peces) Vacuna inmersión Transferencia al Lago Taal, Filipinas, 4 días después de la vacunación. Mortalidad acumulada 54 días después de la vacunación. RPS= 71,3%

136 Ensayo B

137 Ensayo C Alevines 7-8 g 24.000 vacunados y 24.000 control Vacuna oralMortalidad acumulada 84 días después de la vacunación. RPS= 51,1%

138 Ensayo C

139 Vibrio Vacunación IP Truchas w= 9 g PDI 28 díasTratamientos 5 n= 30 peces Vacuna comercial Desafío con: Vibrio anguillarum biotipo I Vibrio anguillarum biotipo II Vibrio ordalli (aislado chileno) v-2-2 Vibrio sp. V-2-1 Control. PBS

140 Vibrio

141 Vibrio

142 Vibrio

143 IPN Vacuna recombinante Vp2 y Vp3 APV Peces pequeñosPrimo vacunación y booster Administración oral Resultados productivos : FCR, SGR, Mortalidad RPS: 61-81%

144 Resultados en Piscicultura24% Más peso

145 13% mayor crec. Both groups started at 0.8 grams and after ten weeks the vaccinates weighed 1.68 and the controls weighed 1.48 giving and SGR improvement of 13%.

146 Resumen de experiencia en Chile60 millones de dosis entregadas Ensayo N° Peces Mort. vac control RPS campo 1 6,89% 21,36% (5,4-100%) 68% 2 6,57% 16,9% (11-22%) 61% 3 5,67% 16,8% (8,75-70%) 66%

147 87% Reduccion Desafio This tank challenge was carried out as an immersion 55 days after vaccination ( ) and shows two replicates of controls and vaccinates The differences between the two groups give an average reduction in mortality of 87% (as quoted in the previous slide) The challenge was done in two stages. The initial exposure did not cause any mortality so the fish were stressed by lowering water level and re-challenged. (Initial challenge had no effect on the fish and didn’t appear to affect the fish immune system) Different doses were also checked but the recommended 0.1ml proved to be the optimal The trial continues with other fish given a booster of 0.1ml 30 days after end of prime vaccination and challenged on and results from this are pending

148 75% Reduccion This tank challenge was carried out as an immersion 55 days after vaccination ( ) and shows two replicates of controls and vaccinates The differences between the two groups give an average reduction in mortality of 87% (as quoted in the previous slide) The challenge was done in two stages. The initial exposure did not cause any mortality so the fish were stressed by lowering water level and re-challenged. (Initial challenge had no effect on the fish and didn’t appear to affect the fish immune system) Different doses were also checked but the recommended 0.1ml proved to be the optimal The trial continues with other fish given a booster of 0.1ml 30 days after end of prime vaccination and challenged on and results from this are pending

149 Comentarios finales APV: Sistema probadoInyectables: seguridad y eficacia RPS altos según el agente