1 Dr. Luis Guillermo Vázquez de Lara Cisneros.Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in vitro e in vivo Dr. Luis Guillermo Vázquez de Lara Cisneros.

2 SUSTANCIA TENSIOACTIVA PULMONAR (SURFACTANTE)Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas

3 Composición del Surfactante Pulmonar (SP)1 Y. Y. Zuo, et al., "Current perspectives in pulmonary surfactant--inhibition, enhancement and evaluation," Biochim. Biophys. Acta 1778(10), 1947 (2008).

4 PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTEHIDROFÓBICAS SP-B SP-C HIDROFÍLICAS SP-A SP-D INMUNIDAD NATURAL

5 Sistema del surfactanteFunción biofísica Disminuye la tensión superficial Evita el colapso alveolar Estabiliza el alveolo Disminuye el trabajo respiratorio Tensión superficial mN/m2 Diámetro de la burbuja Ley de Laplace

6 Sistema del surfactanteFunción en la inmunidad: Fracción lípida Bacteriostático SP-D Aglutinación de bacterias SP-A Opsonización de bacterias Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares. Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y linfocitos alveolares

7 El surfactante en enfermedades pulmonaresModificación de: Concentración Enfermedad de membrana hialina Estructura Deficiencia de SP-B o SP-C Función Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos grasos SIRPA Síndrome de aspiración de meconio Infecciones

8 Sistema del surfactanteOtras funciones: Modulador de la actividad de células que no pertenecen al sistema inmune Fibroblastos pulmonares ?

9 Fibrosis Pulmonar IdiopáticaSe caracteriza por la proliferación de fibroblastos y acumulación de matriz extracelular Las regiones de lesiones crónicas con cicatrización y panalización contrastan con regiones de lesión aguda en donde se observan focos de fibroblastos y miofibroblastos que proliferan activamente . Cool y col.

10 FPI Histológicamente se observan zonas fibróticas en forma de panal de abejas que se alternan con áreas aparentemente sanas.

11 Fibrosis Pulmonar IdiopáticaIncidencia 30 casos por No hay tratamiento Muerte 3 a 5 años después de los primeros síntomas

12 Patogénesis

13 Teoría de una reparación aberranteActivación aberrante del epitelio Liberación de mediadores fibrogénicos por parte de las células epiteliales Estimulación de focos de fibroblastos, disminuyendo su apoptosis y aumentando la liberación de factores fibrogénicos.

14 ANTECEDENTES En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante. El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.

15 Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón humano normal

16 OBJETIVOS Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante. Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.

17 EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO SIN SUERO

18 ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA

19 EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA 18 S 1) CONTROL 2) SP-A 50 g/ml 3) SURVANTA 500 g/ml 4) SURVANTA + SP-A

20 EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL MEDIO DE CULTIVO

21 EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA1) CONTROL 2) SP-A 50 g/ml 3) SURVANTA 500 g/ml 4) SURVANTA + SP-A COLAGENASA 18 S

22 CONCLUSIONES SURVANTA:Induce la apoptosis en cultivos de fibroblastos de pulmón humano normal. Disminuye la expresión génica y síntesis de pro 1(I) colágena. Aumenta la expresión génica de MMP-1 y actividad colagenolítica en el medio.

23 En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un efecto antifibrosante In vivo

24 Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de fibroblastos de pulmón humano normal Yair Romero L

25 Objetivo Determinar el efecto de los fosfolípidos más representativos del surfactante pulmonar en la expresión de colágena en fibroblastos de pulmón humano normal.

26 Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mgEfecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1 sobre la expresión génica de colágena

27 Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.

28 Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs

29 Efecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempo

30 Conclusiones A dosis altas dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina disminuyen la expresión de colágena. A dosis que corresponden a la concentración del surfactante pulmonar en el interior del alveolo, sólo la PE disminuye significativamente la expresión de colágena. La fosfatidiletanolamina actúa de manera tiempo y dosis dependiente.

31 Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis pulmonar en un modelo in vivo

32 Modelo de fibrosis pulmonar in vivoAdministración de bleomicina transtraqueal a ratones susceptibles. Cepa C57BL/6 Se midió: Curva ponderal de los animales Colágena con la técnica de hidroxiprolina y/o Sircoll Analisis histopatológico Tinción de Masson

33 Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada

34 Protocolo para la administración de surfactante inhaladoLos fosfolípidos del surfactante se metabolizan aproximadamente en 48 horas. En el modelo de bleomicina, la fibrosis se obtiene alrededor del día 20

35 Diseño experimental Grupo 1 Solucion salina intrataquealNebulizaciones con solución salina Grupo 2 Bleomicina intratraqueal Grupo 3 Nebulizaciones con surfactante Grupo 4 Nebulizaciones con surfactante + PE Grupo 5 Nebulizaciones con PE

36 Concentración de colágenaGrupo n Colágena total (µg/mL) (promedio±SD) p (comparado con grupo 2) Control (grupo 1) 7 51.9 ± 22.1 .003 Salina (grupo 2) 99.2 ± 8.1 Survanta (grupo 3) 73.6 ± 18.8 .327 Survanta enriquecido con PE (grupo 4) 6 51.02 ± 29.7 .004 PE 5 56.63 ± 24.1 .02

37 Estudio histopatológicoH & E M Control (no bleomicina) PE Survanta + PE Survanta Salina

38 Conclusiones El surfactante enriquecido con fosfatidiletanolamina mejora la fibrosis cuando es administrado tempranamente en el modelo murino de fibrosis pulmonar.

39 IMPLICACIONES En conjunto, estos resultados sugieren que la administración temprana de surfactante pudiera tener un efecto terapéutico en patología pulmonar que conduce a fibrosis del parénquima

40 Agradecimientos Yair Romero López Nathalie Rosales Beatriz Tlatelpa