1 DR. ROBERTO A. HERNANDEZ SALGADOACADEMIA DE POLICÍA ¨WALTER MENDOZA MARTÍNEZ Instituto de Estudios Superiores PRESENTACIÓN PARA OBSTENTAR AL TITULO DE POSTGRADO EN CRIMINALISTICA. L.C.C – P. NAC. NICARAGUA DR. ROBERTO A. HERNANDEZ SALGADO ENERO 2006
2 MICROSATELITES DE CROMOSOMA Y:ESTUDIO DE CINCO MARCADORES GENÉTICOS EN POBLACIÓN DE NICARAGUA. VISIÓN FUTURA DE SU APLICACIÓN PARA LA RESOLUCIÓN DE CASOS EN CRIMINALISTICA BIOLÓGICA DEL LABORATORIO DE CRIMINALISTICA, POLICIA NAC; NICARAGUA. DR. ROBERTO A. HERNANDEZ S.
3 “Yo he puesto delante de ti hoy la vida y el bien; la muerte y el mal”“Yo he puesto delante de ti hoy la vida y el bien; la muerte y el mal” Deuteronomio 30:15
4 INTRODUCCIÓN
5 INTRODUCCIÓN Estudio de ADN, método fiable para identificar a un individuo Introducido en por Whyman y White mediante el estudio de los RFLPs (1980) Su variante VNTR sustituyó a marcadores clásicos (A. Jeffreys, 1985). Para su estudio los marcadores más usados son los STRs. Regiones altamente polimórficas, cuya variación es la base del polimorfismo genético.
6 INTRODUCCIÓN Las repeticiones tetranucleotídicas son las más usadas.Son bandas de pb, caracterizadas por presentar bajas “stutter bands” y alta precisión del tamaño de sus alelos. Su análisis por excelencia es por PCR bajo el sistema múltiplex. Análisis de interés mayor: loci hipervariables de cromosomas sexuales, especialmente la región NO RECOMBINANTE DEL CROMOSOMA Y.
7 POLIMORFISMO DEL CROMOSOMA Y: GENERALIDADES DE LA CITOGÉNETICA DEL CROMOSOMA YUn cromosoma pequeño (60Mb). Eucromátina: cuerpo principal del cromosoma; de tamaño constante (28 Mb), incluyendo brazo corto (Yp11), centrómero y parte proximal del brazo largo (Yq11) 60% de sus secuencias polimórficas son altamente repetitivas. > parte del cromosoma no se recombina. Todas sus secuencias se heredan como un bloque o grupo de ligamiento directo de padre-hijo
8 Cromosoma Y
9 POLIMORFISMO DEL CROMOSOMA Y: GENERALIDADES DE LA CITOGÉNETICA DEL CROMOSOMA YSecuencias eucromática Sec. Heterocromática
10 POLIMORFISMO DEL CROMOSOMA YY-STR TETRAMÉRICOS DEL SISTEMA DYS Locus U.R Alelos Nº de alelos Tamaño (pb) DYS19 (CTAT/C)n 10 – 19 10 DYS385 (GAAA)n 9 – 22 24 DYS389 I (CTG/AT)n 7 – 13 7 DYS389 II 23 – 31 9 DYS390 (GTG/AT)n 18 – 27 DYS391 (CTAT)n 8 – 13 6 DYS393 (GATA)n 9 – 15 Kayser et al. and de Knijff et al. 1997; Schneider et al. 1998
11 POLIMORFISMO DEL CROMOSOMA YNUEVOS MICROSATÉLITES DE CROMOSOMA Y Locus Unidad de Repetición Alelos Nº de alelos Tamaño (pb) DYS437 (TCTA)m (TCTG)n (TCTA)4 13-17 5 DYS438 (TTTTC)1 (TTTTA)0,1 (TTTTc)n 6-13 8 DYS439 (GATA)n 9-14 6 GATA A7.1 (ATAG)n 7/9-12 109/ GAGA A7.2 (TAGA)n(CAGA)1 10-14 GATA A10 (TCCA)2(TATC)n 11-18 GATA C4 (TCTA)2[(TCTA)2(TGTA)2]2,3(TCTA)n 20-25 GATA H4 (AGAT)4CTAT(AGAT)2(AGGT)3(AGAT)Nn24 (ATAG)4(ATAC)1(ATAG)2 25-29 Gusmão y cols, 2001; Ayub y cols, 2000; White y cols, 1999
12 Aplicaciones ForensesSTRS DEL CROMOSOMA Y Aplicaciones Forenses Creación de bancos de datos de perfiles ADN Investigación Biológica de la Paternidad Criminalística Biológica; Estudios Poblacionales Avances en Genética Forenses, etc.
13 OBJETIVOS GENERAL: Iniciar la caracterización genética de la población en Nicaragua mediante el estudio de cinco marcadores microsatélites de Cromosoma Y, que den pauta al proyecto de su aplicación en los casos de interés criminalístico biológico en el Laboratorio Central de Criminalística (LCC) de la Policía Nacional de Nicaragua, ubicado en la ciudad de Managua.
14 OBJETIVOS ESPECIFICOS:-Dar pauta a la posibilidad de crear una base de datos de polimorfismo ADN en el LCC de la Policía Nacional de Nicaragua. Estimar las frecuencias alélicas de los cinco marcadores genéticos STRs de Cromosoma Y en la población de Nicaragua Estimar las frecuencias haplotípicas de los cinco marcadores microsatélites de Cromosoma Y estudiados en la población de Nicaragua.
15 MATERIAL Y MÉTODO
16 OBTENCIÓN DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ADN.Aleatorio simple Mayoría donantes de sangre Venopunción periférica directa Manchas FTA (FTA Classic Card)
17 OBTENCIÓN DE MUESTRAS Y EXTRACCIÓN DE ADN.EXTRACCIÓN: Método Wizard (ReadyAmpTM Genomic – DNA Purification System; Promega Corp. Madinson USA) AMPLIFICACIÓN Termociclador PE 2400 (PE Biosystem); mediante dos sistemas: UNIPLEX (Nievas y cols. 2001) DYS19 MULTIPLEX (White y cols 1999) GATA II
18 UNIPLEX (DYS19) Reactivos y su concentración final:2µl de la solución de ADN extraído 2.5µl tampón 10X Thermophilic Buffer que contiene 500mM KCl (pH 9.0 a 25ºC), 1% triton X-100 1.5µl MgCl2 (25 mM ) 1 µl de cebadores (P1 y P2) a la concentración especificada (0.5µM ) 4 µl de dNTPs (200µm) (dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100mM ) 2U de Taq ADN Polimerasa Thermus Aquaticus Strain YTL (concentración de 5,000 U/ml ) Agua (volumen final 25 µl)
19 UNIPLEX (DYS19) Condiciones PCR: termociclador programable (Gene Amp System 2400 Thermal Cycler, Perkin Elmer , Norwalk, Conté, EEUU) - Inicio: Desnaturalización 94ºC., 1 min. - 30 ciclos: Desnaturalización 94ºC., 20 seg. Acomplamiento 55ºC., 20 seg. Extensión 72ºC., 20 seg. Final: 72ºC., 2 min. Conservación 4ºC., 1 min.
20 MULTIPLEX (GATA II) Reactivos y su concentración final: - 1X GeneAmp 10X PCR Buffer: 100mM Tris-HCl, pH 8.3, 500mM KCl - 2 mM MgCl2 (25mM) - 2 µl de mix de primer (dilución de acuerdo a la concentración final de cada primer) - 200 mM dNTPs (PharmaciaR) 200µm: dATP, dGTP, dCTP, dTTP 100mM. Alícuotas con 5µl de cada dNTP y se añade 380µl de agua. - 0.5 U de AmpliTaq Gold Polimerasa - 2 µl de la solución de ADN extraído - Agua volumen final de 25 µl
21 MULTIPLEX (GATA II) Primer Concentración final GATA A7.1 (F y R)DYS439 (F y R) GATA H4 (F y R) 0.24µM
22 MATERIAL Y MÉTODO Separación de fragmentos: GEL POLIACROLAMIDA 6% (Ready Mix Gel ALF grade, Pharmacia). Electroforesis: Secuenciador automático (ALF DNA Sequencer, Pharmacia Biotech®, Uppsala, Suecia) a 1450 V, 38 mA, 45W y 50ºC., por 220 min. Medición y cuantificación de los productos PCR: Programa de análisis de fragmentos (Fragment Manager).
23 Análisis de FragmentosGEPY II 4 3 2 Alelos 1 Muestra Referencia
24 MATERIAL Y MÉTODO ELECTROFORESIS: Condiciones:Preparación previa de los productos PCR: - 1.8 µl de producto amplificado (muestra) - 3 µl de tampón de carga, azul de dextrano 5 mg/ml en formamida desionizada 2 µl de marcadores internos de peso molecular ELECTROFORESIS: Condiciones: - Voltaje: voltios (V/cm) - Potencia: vatios (W) - Intensidad: 60 miliamperios (mA) - Temperat: 55ºC - Tiempo: min. en placas pequeñas
25 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
26 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRAFICO Nº 1:- Distribución de frec. Alélicas DYS19 FRECUENCIA ALELICA ALELOS
27 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRÁFICO Nº 2:- Distribución de frec. Alélica GATA II (A7.1) FRECUENCIA ALELICA ALELOS
28 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRÁFICO Nº 3:- Distribución de frec. Alélica GATA II (A10) FRECUENCIA ALELICA ALELOS
29 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRÁFICO Nº 4:- Distribución de frec. Alélica GATA II (DYS439) FRECUENCIA ALELICA ALELOS
30 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRÁFICO Nº 5:- Distribución de frec. Alélica GATA II (H4) FRECUENCIA ALELICA ALELOS
31 RESULTADOS Y DISCUSIÓNGRÁFICO Nº 6:- Distribución haplotípica DYS19-GATA II 11 CASOS C/U 9 CASOS HAPLOTIPOS 8 CASOS FRECUENCIAS HAPLOTIPICAS
32 CONCLUSIONES PRIMERA El análisis de los cinco marcadores polimórficos de cromosoma Y estudiados (DYS19, GATA A7.1, GATA A10, DYS439 y GATA H4) da lugar al inicio de la creación de una Base de Datos de marcadores genéticos cuyo uso facilite la identificación genética en las investigaciones de identidades en los casos de filiación parental e identificación de los responsables en casos de delitos sexuales por violación, homo y heterosexual.
33 CONCLUSIONES SEGUNDA El estudio refleja una herencia haplotípica, hasta el avance actual, de 56 haplotipos diferentes como resultados de las combinaciones alélicas de los cinco marcadores analizados; advirtiéndose de la existencia, aún mayor, de combinaciones alélicas sin estudiar hasta tanto no darle continuidad a este trabajo, lo que llevaría al conocimiento de su frecuencia real.
34 CONCLUSIONES TERCERA Las frecuencias haplotípicas obtenidas reconfirman la gran limitante que presenta el análisis de forma única de los marcadores polimórficos de cromosoma Y para la identificación genética poblacional, demostrando que todos aquellos individuos de una misma línea paterna comparten igual información genética de sus haplotipos; lo que hace pensar erróneamente que la población estudiada es meramente endogámica por su alta incidencia homocigótica.
35 CONCLUSIONES CUARTA La aplicabilidad de los marcadores genéticos estudiados se ve muy limitada por no disponer con un estudio mayor o representativo de la cantidad de marcadores genéticos.
36 RECOMENDACIONES PRIMERADado este primer paso, sugiero y recomiendo dar continuidad y ampliar el presente estudio con el análisis de nuevos sistemas de marcadores genéticos, a fin de establecer comparaciones con otras poblaciones centroamericanas para un aporte mayor a la implementación de este sistema investigativo en Nicaragua.
37 RECOMENDACIONES SEGUNDAPara evitar criterios como lo descrito en la parte tercera de las conclusiones se hace necesario que estos estudios tengan que acompañarse conjuntamente con análisis de marcadores autosómicos para descartar cualquier nexo o vínculo parental que pudiera existir entre cada individuo estudiado.
38 AGRADECIENDO SU ATENCIÓNMUCHAS GRACIAS