1 Dra. Sandra Orozco SuárezUnidad de Educación, Investigación y Políticas de Salud Un Enfoque Multidisciplinario en el Estudio de la Epilepsia Farmacorresistente Pediátrica Dra. Sandra Orozco Suárez

2 Grupo Multidisciplinario Para el Estudio y Tratamiento de la Epilepsia FármacorresistenteUnidad de Investigación Médica en Enfermedades Neurológicas, Unidad de Investigación Médica en Inmunobiologìa, Hospital de Especialidades, Centro Médico Nacional Siglo XXI Departamento de Neurocirugía, Departamento de Neurología, (3).Hospital de Pediatría, CMN. Siglo XXI Departamento de Neurofisiología, Hospital de Pediatría, CMN. Siglo XXI (4), Departamento de Psicología Hospital de Pediatría. Centro Médico Nacional Siglo XXI. Departamento de Neurología Pediátrica, Hospital General, Centro Médico Nacional “La Raza Dra. Sandra Orozco- Suárez (1), Dario Rayo Mares D, Dr. Gerardo Sánchez Vaca (5) , Dr. Jaime Diegopérez Ramírez (2), Dra. Griselda Ramírez Reyes (2), (3), Dra. María Inés Fraire Martínez (4), Dr. Rodolfo Cabrera (3). Dra. Justina Sosa Maldonado (6) Dr. Jaime Ruíz Chavez(6), Dr. Jefferson Proaño Narváez (1) Dra. Iris Feria Romero (1), Dra. Lourdes Arriaga(2) Israel Grijalva Otero (1*)

3 Crisis convulsivas en neonatos e infantesEl periodo neonatal es el periodo más vulnerable para desarrollar crisis epilépticas. Este riesgo es debido a la hiperexcitabilidad del cerebro neonato. Prevalencia /1000 Incidencia 1.8 a 3.5 / 1000 HA Etiología Encefalopatía isquémica o hipóxica (40% - 60%) Hemorragia intracraneal (7% - 18%) Malformaciones del desarrollo cortical (5% - 9%) Neuroinfecciones Del 20-30% de los pacientes con epilepsia que son refractarios al tratamiento con fármacos antiepilépticos (FAE) ,generan un costo Institucional (IMSS) de $ dólares/paciente Particularmente en los primeros dos años de vida (30%)

4 EPILEPSIA REFRACTARIAReorganización anormal de los circuitos neuronales CAUSAS Inicio temprano de las crisis Alteración de los receptores neuronales Lesiones cerebrales estructurales Patologías en los canales iónicos Elevada frecuencia de crisis antes del inicio del tratamiento EPILEPSIA REFRACTARIA Autoinmunidad reactiva Tipo de crisis o epilepsia Alteraciones a nivel barrera hematoencefálica Historia de crisis febriles Penetración alterada de los fármacos antiepilépticos UMAE Hospital de Especialidades, C.M.N. Siglo XXI (Semah 1998, Regesta y Tanganelli, 1999, Sisodiya, 2002)

5 Epilepsia farmacorresistenteAquella en la que existe falla a dos regímenes terapéuticos (apropiados y bien tolerados), ya sea como monoterapia o en combinación para lograr la libertad de crisis sostenida. Pacientes categoría 1. Favorable al tratamiento actual del FAE Si Responde al tratamiento No Pacientes actualmente con ≥2 FAEs y con categoría 2 Pacientes categoría 2 con 1 FAE (puede tener otro FAE y ser categoría 3), previamente con 1 FAE clasificado como categoría 2 Indefinido Paciente farmacorresistente Aunque hoy día no se tiene una definición como tal de ERTAFAR, la definición que permitió catalogar al grupo de estudio es la siguiente ALGORITMO PARA ER ILAE, (Patrick Kwan y col. Epilepsia, 2010).

6 FACTORES ASOCIADOS A LA PROPIA EPILEPSIA PREDETERMINACION GENETICAFACTORES CLÍNICOS ASOCIADOS A EPILEPSIAS DE DIFÍCIL CONTROL – Inicio temprano de las crisis convulsivas (menos de 2,9 años). – Crisis parciales simples. – Crisis mioclónicas. – Antecedentes de estados epilépticos. – Etiología sintomática de las crisis epilépticas. – Resonancia magnética cerebral anormal. FACTORES ELECTROENCEFALOGRÁFICOS ASOCIADOS A EPILEPSIAS DE DIFÍCIL CONTROL – Ritmo de fondo anormal (incluye lentificación difusa, asimetría y amplitud). – Presencia de espigas y ondas de alto voltaje. – Actividad espiga onda focal. FACTORES ASOCIADOS A LA PROPIA EPILEPSIA PREDETERMINACION GENETICA

7 DIAGNOSTICO ENCEFALITIS AUTOINMUNE ENCEFALITIS DE TIPO VIRALIonotropic Glutamate Receptors NMDA AMPA KAINATO NR1 NR2A-D NR3A GluR GluR KA1,2 w ENCEFALITIS AUTOINMUNE ENCEFALITIS DE TIPO VIRAL SINDROME PARANEOPLASICO

8 Lymphocytes La citometria de flujo ha permitido establecer la respuesta inmune a nivel del SNC con una mayor sensibilidad, corroborado con el estudio histopatologico

9

10 suero LCR Albumina-LCR Suero LCR 1900 342 5.55555556 230 8.26086957520 350 600 450 320 5.9375

11 C

12 Epilepsia Volume 52, Issue SUPPL. 3, May 2011, Pages 26-32

13 Albumin extravassation

14 CD4+ CD8+ Microglia RD

15 BBB/AD REMOTA EVR 6000X

16 *p <0.05 ** P < 0.02 T Lmphocytes CD4+ CD4/HLA- Dr+ CD8+ CD8+/HLA-Dr

17 A B C D E F MALFORMACIONES DEL DESARROLLO CORTICAL I II III IV V VIDISPLASIA ILAE TIPO IB D E F 200µm I II III IV V VI I II III IV V VI

18 Indicaciones para la realización delEstudio Genético Confirmación molecular de un diagnóstico clínico reduciendo significativamente los procedimientos diagnósticos. Optimización del tratamiento y el manejo clínico del paciente epiléptico en base al origen de su enfermedad. Identificación de familias portadoras de mutaciones específicas a través del estudio de un miembro afecto.

19 Ácido valproíco Lamotrigina Fenitoína Topiramato Carbamacepina Fenobarbital Levetiracetam CYP3A4 CYP2C19 CYP2D6 CYP2C9 Hidroxilación Omegaoxidación Los estudios de farmacogenética se realizan cuando hay diferencias en las concentraciones de fármaco en suero y en la distribución de metabolitos de drogas examinados bioquímicamente en pacientes con diagnósticos idénticos

20 Variabilidad genética y su posible efecto en la respuesta individual a los fármacos antiepilépticosDROGA ANTIEPILÉPTICA CYP450 CARBAMAZEPINA CYP3A4,CYP1A2,CYP2A6,CYP2C8, CYP2C19, CYP2D6, UGT1A6, UBG2B ACIDO VALPROICO 50% por UGT, CYP2C9, CYP2C19 FENITOINA CYP2C9, CYP2C19, UGT FENOBARBITAL CYP2C9, CYP2C19 PRIMIDONA GABAPENTINA 95% se excreta por riñón sin cambios, el resto por transaminasas y vitamina B6 TIAGABINA CYP3A4, UGT TOPIRAMATO 80% se excreta por riñón, el resto por CYP2C9, CYP2C19 FELBAMATO CYP2E1, CYP3A4, CYP2C19 LAMOTRIGINA > 70% por UGT1A4, 10% se excreta sin cambios LEVITERACETAM 60% se excreta sin cambios, 24% hidrólisis de acetamida y 2.5% por la vía de CYP450

21 ESTUDIOS GENETICOS Paciente portador de epilepsia parcial asintomático. Pacientes con patologías sanguíneas Edad de 1 a l6 años. Pacientes pediátricos con epilepsia parcial compleja Con anticoagulantes Diagnóstico de epilepsia parcial compleja refractaria y no refractaria. Con daño hepático Padres biológicos Con crisis de patrón mixto Que acepten ingresar al proyecto ambos padres. Todos aquellos que no aceptarán ingresar al protocolo. Con exámenes de laboratorio Cuando el paciente lo solicite

22 Hipótesis de los mecanismos de farmacorresistenciaHipótesis de los blancos terapéuticos A B Blanco Fármaco C Hipótesis de transportadores multifármacos Refractario a tratamiento Normal Torrente sanguíneo Glía Neurona MDT’s Célula endotelial Fármaco Receptor Figura 2. Representación esquemática de las hipótesis de los mecanismos de refractoriedad en ELT (basados en Remy S. y Beck H. 2006). A y B) hipótesis de los blancos terapéuticas. A) el fármaco (ligando) es reconocido por su receptor (blanco) permitiendo el acoplamiento correcto entre ambos. B) el receptor a sufrido modificaciones estructurales en el sitio de unión del ligando (fármaco) lo cual a pesar de ser reconocido no se genera el acoplamiento correcto bloqueando el efecto terapéutico esperado. C) hipótesis del transportador multi-fármacos. La BBB es una barrera selectiva que solo permite el paso de sustancias altamente lipofílicas (como muchos antiepilépticos) por difusión simple al interior del cerebro (flechas continuas). Como un mecanismo de defensa, la BBB expresa proteínas MDT’s como son glicoproteina P y MRP’s que se expresan en las células endoteliales y actúan como bombas de eflujo, recogiendo el fármaco del espacio intersticial para introducirlo de nuevo al torrente sanguíneo (flechas discontinuas) controlando así la concentración de sustancias en el cerebro. En el cerebro epileptogénico con refractoriedad, se observa mayor presencia de MDT’s en las células endoteliales lo cual evita que el fármaco llegue a su blanco terapeutico generando la refractoriedad en el paciente. BBB: barrera hematoencefálica; MDT’s: transportadores de multi-fármacos; MRP’s: proteínas asociadas a la resistencia a multi-fármacos, Basado en Remy S. y Beck H. Brain 2005

23 VARIABILIDAD METABÓLICAGen con mutaciones Gen Simple Sobre-expresión del gen Alteración al substrato especifico Sin enzima Enzima Inestable Enzima normal Altos niveles de enzima No metaboliza Reduce su metabolismo Metabolismo normal Para otros metabolitos Incrementa el metabolismo (Magnus 1999,Casandra 2006)

24 Datos clínicos de los pacientes con epilepsia parcial compleja farmacorresistentes y controlados.Edad (años ± sd), rango 10.23 ± 0.78 (1-15) 10.53 ± 1.56 (1-15) Género (F/M) 14:8 * 3:4 Inicio de las crisis (años ± sd), rango 4.38 ± 0.81 (1-14) 4.57 ± 1.43 (2-10) Número de crisis/mes 63.45 ± (3-450) Años con crisis 5.85 ± 0.84 (1-12) Tiempo controlados (años ± sd) rango ----- 1.9 ± 0.28 (0.6-2) AVP dosis mg/día 598.0 ± 129.7 814.3 ± 212.1 AVP concentración/saliva (mg) 0.57 ± 0.12 1.68 ± 0.59 AVP concentración /plasma (mg) 31.62 ± 8.03 35.17 ± 18.04 CBZ dosis mg/día 900.0 ± 100.0 600.0 ± 200.0 CBZ concentración/saliva (mg) ± 1.017 ± 0.034 CBZ concentración /plasma (mg) 5.900 ± 0.156 6.76 ± 0.29 PHT dosis mg/día 145.0 ± 55.00 PHT concentración/saliva (mg) ± PHT concentración/plasma (mg) 3.150 ± 1.750 LEV dosis mg/día 1250 ± 322.7 LEV concentración/saliva (mg) 1.661 ± LEV concentración/plasma (mg) 4.657± *p= 0.1 F= femenino; M= masculino; AVP= ácido valproíco; CBZ= carbamazepina; PHT= fenitoína; LEV= levetiracetam.

25 Polimorfismos del gen ABCB1SNPs Región Presente Ausente rs Exón 2 X rs Exón 11 rs Exón 12 rs Exón 14 rs Exón 21 rs Exón 26 rs Exón 28 rs 5’UTR rs Intrónica rs

26 Frecuencias polimórficas del gen ABCB1Exón SNPs Nucleótido Asociación proteíca Frecuencia (%) Heterocigoto Homocigoto Aminoácido Localización Exón 11 1199 G→A Ser→Asn 400: sitio de unión; 2° dominio citoplasmático 9.09 100 Exón 12 1236 C→T Sinónimo Gly→Gly 412: 2º dominio Citoplasmático; cadena beta 59.1 38.5 61.5 Exón 21 2677 T→G Ser→Ala 893; 3er dominio citoplasmático; cadena alfa-hélice 46.2 53.8 Exón 26 3435 Ile→Ile 1145; 4º dominio citoplasmático 48.6 Intrón 26-exón 27 rs Intrónica Intrón entre el exón 25 y 26 18.18 rs intrónica 40.9 44.5 55.5

27 Polimorfismos del gen ABCC2SNPs Región Positivo Negativo rs Exón 10 X rs Exón 25 rs rs Exón 28 rs Exón 29 66744 T>G X (no reportado) 68049 T>A 67967C>A 68072C>A 68088 G>C Intrón entre el exón 29 y 30

28 Cromatogramas que muestran los cambios encontrados en el gen ABCC2 en pacientes pediátricos mexicanos con epilepsia farmacorresistente. A) Cambio 66744T>G localizado en el exón 28. B) Cambio C>A localizado en el exón 29.

29 Frecuencias polimórficas del gen ABCC2Exón SNPs Nucleótido Asociación proteica Frecuencia (%) Heterocigoto Homocigoto Aminoácido Localización Exón 28 66744 T→G Ile → Ser 1324; 4º dominio; región citoplasmática 22.7 100 66745 C→T Ile →Ile 41 66.7 33.3 29 67967 C→A Ser→Ser 1342; 4º dominio; región citoplasmática 9.1 68049 T→A Leu→ His 1373; 4º dominio; región citoplasmática 0.0 68072 Pro→Thr 1381; 4º dominio región citoplasmática Intrón entre el exón 29 y 30 68088 G→C intrónica Región intrónica entre el exón 29 y 30 4.5

30 SNIP´s IDENTIFICADOS EN CYPsGEN EXÓN SNP POSICIÓN SECUENCIA REGIÓN NO REP/REP CAMBIO rs ACTIVIDAD ENZIMATICA CYP2D6 1 C INS 1551 GCCTGCGTCCT INTRÓN NO REPORTADO ¿? C1719 T GCTACCCACCA REPORTADO P 34 S rs NULIFICA C INS 1854 CAGAACGCAAA 3 T INS 6605 CTGCGTCGGAG C INS 6606 TGCGTCGGAGA C INS 6634 GGAGTCGGGTG G/C 6752 TCCGTGTCCAC VAL rs DISMINUYE C/G 6752 TCCGTCTCCAC G/A 6937 CCCCAGGAGGC INT-EX A/G 6937 CCCCAAGAGGC EXÓN 4 5 C INS 7528 CTGGTCGTAGG A/G 7560 CCTGCATATCC G/A 7560 CCTGCGTATCC G/C 7641 GCACAGGATGA NO REP Y DEL A C/G 7641 GCACACGATGA A/C 7656 CACCCAGCCCA C/A 7657 CACCCCGCCCA 6 C INS 7837 GTGCACGAATT C 7941 T ACCTGCGCATA R 296 C G 8041 C GCAGCGTGAGC 325 H rs030418 G/A 8079 GGGAGGAAGGG rs A/G 8079 GGGAGAAAGGG CYP2C9 A DEL 24080 TATTAAATGCT C INS 24091 TTTTACTTTAA A INS 24153 TTCCCAGGGAA

31 Metas La identificación de biomarcadores genéticos permitirá individualizar a aquellos casos de farmacorresistencia, mediada por la sobreexpresión de transportadores de eflujo. Algunos de los marcadores tienen su base en el genotipo de los pacientes, mientras que otros en sus fenotipos, principalmente condicionados por fenómenos cinéticos sistémicos. Proporcionar un mejor seguimiento farmacoterapéutico de los pacientes en las concentraciones de fármaco en saliva, métodos utilizados desde hace muy largo tiempo (1991), y que recientemente fue estandarizado en nuestro laboratorio para pacientes mexicanos. Identificar en la población mexicana y latina las principales causas que generan la resistencia a tratamiento farmacológico, apoyado en las teorías: La farmacodinámica que describe la resistencia a fármacos por la modificación de moléculas blanco como canal de sodio SCN1A y GABABBR1 Y GABRB3; y La farmacocinética que se inclina por la sobreexpresión de moléculas transportadoras asociadas a la farmacorresistencia como las proteína PgP y MRP2.

32 Conocer la variabilidad metabólica de las drogas por su relación con los alelos de los citocromos P450 (CYP-450); CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 y CYP2D6. Mejorar la infraestructura Institucional en lo que respecta a: implementar y fortalecer los laboratorios de la Unidad de investigación, así como los servicio de neurofisiología, neurocirugía y neurología, con tecnología de punta enfocada al servicio de la salud. Consolidar a jóvenes investigadores; seguir formando estudiantes a nivel de Maestría y Doctorado; e involucrar a estudiantes de la subespecialidad en neurología. MEJORAR LA CALIDAD DE LA ATENCIÓN Y LA CALIDAD DE VIDA DE LOS PACIENTES Y AHORRAR RECURSOS A LARGO PLAZO PARA LA INSTITUCIÓN.

33 Epilepsy PRODUCTOS Original Research ARTICLE                                                                                                                                                                                                                                                                                            Epilepsy Original Research ARTICLE Front. Neurol., 09 October 2014 | doi: /fneur MDR-1 and MRP2 gene polymorphisms in Mexican epileptic pediatric patients with complex partial Genetic polymorphisms associated with antiepileptic metabolism. Frontiers in Bioscience E6, , June 1, 2014] Genetic variants of CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19 and CYP3A4 and their relationship to antiepileptic drug concentrations in pharmacoresistant Mexican pediatric epilepsy patients. frontiers in Molecular and cellular neuroscience PRODUCTOS Expression of ABC transporter proteins and their relation with inflamatory processes in rasmussen encephalitis. 1Orozco-Suárez S, 1Pérez-Camargo A., 1Alanis-Olvera Ma. 1Feria-Romero I.,2Diego-Pérez J.,3Rayo D., 4Fraire-Martinez Ma.I.,3 Sánchez-Vaca G., 1Grijalva Expression of cation-chloride co-transporters, NKCC1 and KCC2 in biopsies from patients with intractable epilepsy associated with malformations of cortical development. 1Orozco-Suárez S, 1Pérez-Camargo A., 1Alanis-Olvera Ma. 1Feria-Romero I.,2Diego-Pérez J.,3Rayo D., 4Fraire-Martinez Ma.I.,3 Sánchez-Vaca G., 1Grijalva I.

34 GRACIAS ESTUDIANTES, RESIDENTES, PERSONAL TECNICO Y ADMINISTRATIVO DE LA UIEM Y DE LOS SERVICIOS DE NEUROLOGIA, NEUROFISIOLOGIA, NEUROCIRUGIA, SALUD MENTAL, E IMAGEN DEL HOSPITAL DE PEDIATRIA, INSTITUTO NACIONAL DE NEUROLOGIA, CINVESTAV, CENTRO DE MOMNITOREO DE FARMACOS. URUGUAY

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