1 Laboratoryjne metody wykrywania wirusów i ich przydatność w monitoringu terenowymDr.rer.nat.et med.habil. Hans-Christoph Selinka, Federalna Agencja Środowiska, Berlin, Niemcy EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

2 Drogi przenoszenia patogenów związanych ze środowiskiem wodnymSpożycie (z płynami) Wdychanie i aspiracja (z aerozolami) Kontakt (podczas mycia) Droga zakażenia (może wystąpić sepsa oraz zakażenie ogólne) Żołądkowo-jelitowa Oddechowa Skórna (szczególnie przy otarciach), przez błony śluzowe, rany, oczy Bakterie Campylobacter spp. E. coli Salmonella spp. Shigella spp Vibrio cholerae Yersinia spp. Wirusy Adenovirusy Astrowirusy Enterowirusy wirus WZW A wirus WZW E Norowirusy Rotawirusy Sapowirusy Pierwotniaki i robaki jelit Cryptosporidium parvum Dracunculus medinensis Etamoeba histolytica Giardia intestinalis Toxoplasma gondii Legionella pneumophila Mykobakteria (niegruźlicze) Naegleria fowleri Zakażenia Szereg innych czynników w warunkach szczególnego narażenia Acanthamoeba spp. Aeromonas spp. Burkholderia pseudaomallei Mykobakterie (niegruźlicze) Leptospira spp.* Pseudomonas aeruginosa Schistosoma mansoni* L ADENOWIRUS NOROWIRUS ROTAWIRUS L ADENOVIRUS NOROVIRUS ROTAVIRUS J J WHO 2004, Guidelines for Drinking Water Quality EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

3 Struktura ramowa analizy ryzykaOcena ryzyka *Podstawy naukowe Zarządzanie ryzykiem *Zgodnie z polityką Komunikowanie *Interaktywna wymiana informacji i opinii w zakresie ryzyka odpowiednie metody Źródło: WHO Food Safety EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

4 Dzisiaj nie będę mówić o…Parametr Dyr. UE dot. wody pitnej Dyr. UE dot. wody w kąpieliskach Liczba kolonii DIN EN ISO 6222 E. coli DIN EN ISO DIN EN ISO DIN EN ISO Enterococci DIN EN ISO DIN EN ISO DIN EN ISO Pseudomonas DIN EN 12780 aeruginosa ... ale raczej o: starych – ale reaktywowanych i w międzyczasie wystandaryzowanych – oraz nowych obiecujących metodach stosowanych w mikrobiologii wody i molekularnej wirusologii (wzbogacaniu i oczyszczaniu wirusów z próbek wody, badaniu zakaźności bakteriofagów i wirusów, lub metodach wykrywania wirusów w oparciu o PCR…) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

5 badania liczebności i zakaźności bakteriofagów DNA i RNApobieranie próbek wody do analizy wirusów oczyszczanie wirusów z próbek wody przy użyciu filtra z włókna szklanego ekstrakcja kwasu nukleinowego do analizy genomu wirusa rola inhibitorów środowiskowych wykrywanie wirusów metodami PCR badanie zakaźności wirusów w kulturze komórkowej Phage MS2 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

6 Wykrywanie i oznaczanie liczebności bakteriofagówFagi F+RNA DIN EN ISO :2001 Fagi somatyczne DIN EN ISO :2001 Fagi B. fragilis DIN EN ISO :2001 Fagi F+RNA F-Pilus Fagi somatyczne F+ Bacterium Bacterium EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

7 Wykrywanie bakteriofagów testem łysinkowymEU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

8 Oznaczanie liczebności bakteriofagów w próbkach wody Fagi F+RNA Fagi somatyczne DIN Szczep Salmonella thyphim E.Coli/CN żywicielski: ( WG49; NCTC ) lub ( WG5; ATCC ) E.coli K-12 Hfr ( ATCC ) Dolny agar: Tryptone-Yeast-Glucose Agar Modif. Scholten‘s Agar (TYGA) ( MSA ) Górny agar: ssTYGA (0,8% agar) ssMSA (0,8% agar) Kwas nalidyksowy: 100 µg/ml µg/ml Granica wykrywalności: pfu/50 ml pfu/50 ml Fag wzorcowy: MS PhiX174 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

9 Morfologia płytek bakteriofagówPRD1 PhiX174 MS2 EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

10 Morfologia płytek bakteriofagówC.Fuchs Próbki uzyskane z brudnych wód powierzchniowych: zaleca się dodanie kwasu nalidyksowego, aby zapobiec wzrostowi innych bakterii EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

11 Badanie bakteriofaga – karta testu jakościowego„Karta przewodnia” Kolifag somatyczny PhiX 174 Ar + Bri 110 100 90 80 70 pfu / ml 60 50 40 30 20 9.7.08 7.9.08 Data x-3s x-2s x x+2s x+3s Kontrolna seria z wzorcowym fagiem w tych badaniach jest na poziomie 45 pfu/ml EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

12 Monitorowanie wirusów – pobieranie próbZwiązki chemiczne Rozkład statystyczny Wirusy Skupiska! EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

13 Próbobranie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

14 Ogólny zarys wykrywania wirusów w wodzie surowejPróbka 10 ml odpowiednia dla biologii molekularnej i wirusologii 100 µl oczyszczonych kwasów nukleinowych wirusów 10-litrowa próba wody ( DNA / RNA ) próbka wody surowej Wykrywanie wirusa metodą PCR Pobieranie prób wody o dużej objętości Zmniejszenie objętości próbek (1:1000) Ekstrakcja kwasów nukleinowych wirusów Testy wykrywające wirusy Infectivity assays EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

15 Klasyczne metody wzbogacania wirusów w próbkach wodyCechy wirusa Metody Polarność powierzchniowa kapsydu Adsorpcja / Wymywanie Rozmiar cząsteczki Filtracja membranowa (Ultrafiltracja) Gęstość Ultrawirowanie EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

16 Koncentracja wirusów przy użyciu filtrów z włókna szklanegoEU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

17 W terenie… EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

18 Włókno szklane – badania polowe dużych objętościPróba wody: litrów litrów EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

19 Oczyszczanie bakteryjnych kwasów nukleinowych (DNA/RNA) z próbek pobranych ze środowiskaEU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

20 Oczyszczanie DNA i RNA liza etapy mycia elucja Bufor do lizykroki powtarzane 5 razy 2x 50 µl Bufor do elucji Krzemionka Próbka 5ml 5 min 60°,1400 rpm EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

21 Budowa bakteriofagów i wirusów chorobotwórczych dla ludziWirus RNA Wirus DNA Zdjęcia: dzięki uprzejmości J.Y. Scro EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

22 Amplifikacja informacji genetycznej wirusówDNA RNA Białko Odwrotna transkrypcja 5’---CTCAGCGTTACCAT---3’ 3’---GAGTCGCAATGGTA---5’ 5’---CUCAGCGUUACCAU---3’ N---Leu-Ser-Val-Thr---C DNA RNA BIAŁKO Transkrypcja Translacja EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

23 Wykrywanie wirusów metodami PCRkonwencjonalne PCR (jakościowe) DNA / RNA PCR czasu rzeczywistego (ilościowe) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

24 Amplifikacja informacji genetycznej wirusów poprzez polimerazową reakcję łańcuchową (PCR)Wirusy DNA Wirusy RNA PCR RT-PCR EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

25 Nested (RT)-PCR NOROWIRUS ADENOWIRUS WZW A WIRUS (nested RT-PCR)(nested PCR) WZW A WIRUS (nested RT-PCR) (Mediagnost R) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

26 Real-Time TaqManTM PCRŁączy amplifikację docelowego DNA z ilościową detekcją amplikonów w tym samym naczyniu Adenowirus 41 wzorzec kopii Potrzebne są tylko: (1) matryca (próbka DNA) (2) nieoznaczona para dla starterów (3) specyficzna sonda w obrębie amplikonu oznakowana 2 fluorochromami (np. reporter FAM i wygaszacz TAMRA) (4) Mastermix (koktail odczynników) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

27 Real-time PCR Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconychTesty / próbki: µl próbka µl próbka + Ad Wzorzec µl próbka µl próbka 1:10 Na amplifikację kwasów nukleinowych z próbek pobranych ze środowiska często negatywnie wpływa obecność inhibitorów. Dlatego zaleca się badanie próbek wzbogaconych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

28 Badanie zakaźności adenowirusaKomórki A549 potraktowane próbkami wody z pozytywnym wynikiem testu Real-time PCR na obecność adenowirusa zakażone komórki wykazują efekty cytopatyczne (CPE) po 2-14 dniach następnie próbki poddaje się kolejnemu badaniu PCR „Integrated Cell Culture PCR“ (ICC-PCR) (A. Heim) EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

29 Metody wykrywania wirusaMetoda wykrywania Hodowla komórkowa RT-PCR ICC-PCR L J J Skraca czas wykrywania J J L J Wykrywa zakaźnego wirusa L L J Wykrywa jedynie żywe organizmy L J J Wykrywa żywe wirus nie nadające się do hodowli J L J Odporna na wpływ substancji hamujących PCR J L J O zwiększonej czułości EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

30 Badanie zakaźności enterowirusaa) Test TCID b) Test łysinkowy kontrolna CVB3 Potwierdzenie obecności zakaźnych wirusów przez wyliczenie jednostek tworzących łysinki (pfu/ml) na komórkach HeLa. Charakterystyka wariantów wirusa Coxcakie B3 (CVB3) na wybranych liniach komórkowych EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

31 Podstawowe techniki monitorowania wirusów- wydajna metoda koncentracji wirusów - skuteczna technika ekstrakcji DNA/RNA systemy PCR dopasowane do wirusów ( PCR, nPCR, RT-PCR, nRT-PCR, Real-time PCR ) systemy hodowli komórkowych do badania zakaźności Techniki zaawansowane: - Multiplex PCR; ICC-PCR, technologia mikroczipowa EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka

32 Dziękuję Państwu! EU Twinning Project PL06/IB/EN/01, Component 2, Activity 2.3, Warsaw, March 09-13, Selinka