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2 Efecto de temperatura y reguladores de crecimiento en iniciación, diferenciación, floración y expresión de genes Dra. María Hilda Pérez Barraza Investigadora del Programa de Investigación Frutales INIFAP-México [email protected] Dra. María Hilda Pérez Barraza Investigadora del Programa de Investigación Frutales INIFAP-México [email protected]

3 CONTENIDO Introducción PROCESO DE FLORACIÓN

4 Importancia Nayarit > 25 mil ha CULTIVARES Ataulfo Keitt Tommy Atkins Haden Kent Manila 2513.7 PP: 1200 mm Jun - Oct 22 - 27 °c

5 Factores que afectan Proceso de floración ENDÓGENOS ♦ Relación carbono/nitrógeno ♦ Excesiva carga de fruto ♦ Crecimiento vegetativo ♦ Vigor de portainjerto ♦ Distancia de yema al sitio de captación de estímulo ENDÓGENOS ♦ Relación carbono/nitrógeno ♦ Excesiva carga de fruto ♦ Crecimiento vegetativo ♦ Vigor de portainjerto ♦ Distancia de yema al sitio de captación de estímulo EXÓGENOS Fotoperiodo y Luz Temperatura Precipitación EXÓGENOS Fotoperiodo y Luz Temperatura Precipitación MANGO HORTÍCOLAS Cosecha anterior Riego Nutrición balanceada (N) Poda Aclareo de frutos Anillado Doblado de ramas HORTÍCOLAS Cosecha anterior Riego Nutrición balanceada (N) Poda Aclareo de frutos Anillado Doblado de ramas HORMONAS ▪ Giberelinas ▪ Transporte polar de auxinas ▪ Citocininas ▪ Etileno

6 Temperaturas Frescas 20/15 - 18°C Hojas Maduras Temperaturas Frescas 20/15 - 18°C Hojas Maduras Temperatura Cálidas > 25/20 °C Presencias de hojas Inmaduras Temperatura Cálidas > 25/20 °C Presencias de hojas Inmaduras Madurez fisiológica (6 meses??) T° < 20°C Edad del brote Inmaduros Madurez fisiológica (6 meses??) T° < 20°C Edad del brote Inmaduros Condiciones No Inductivas Condiciones Inductivas TROPICO SUBTROPICO 1.Temperatura: Condiciones Inductivas y no Inductivas para Floración 1.Temperatura: Condiciones Inductivas y no Inductivas para Floración Condiciones Inductivas Condiciones No Inductivas

7 Proceso de floración: Nayarit México Noviembre Brote del año Inducción/ Iniciación Noviembre – diciembre Temperatura (15 –

8 Temperaturas cálidas >20°C octubre, noviembre y parte de diciembre Brotación vegetativa Brotación vegetativa Nayarit: Octubre – Diciembre 2008 2008 > Precipitación que 2007 530 – 730 mm más Lluvias Junio – Octubre, Nov Condiciones no inductivas Otoños cálidos y húmedos Floración Irregular 2009

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10 Flujos de crecimiento Octubre 2013 Noviembre 2013

11 Diciembre 2013

12 Condiciones en 2013  Muy similares a 2008  Otoños cálidos y alta humedad  Octubre - Diciembre. Condiciones en 2013  Muy similares a 2008  Otoños cálidos y alta humedad  Octubre - Diciembre. Floración Irregular 2014 TEMPERATURAS ALTAS (> 30/20 °C) Y PRECIPITACIÓN DURANTE EL PERIODO DE DIFERENCIACIÓN FLORAL (CONDICIONES NO INDUCTIVAS) OCASIONAN ABUNDANTE BROTACION VEGETATIVA Y FLORACIONES IRREGULARES Y/O NULAS EN EL CULTIVO DE MANGO

13 Número de flores Establece el año anterior a la producción inducción, iniciación y diferenciación floral 2. Reguladores de crecimiento. Inducción, Iniciación y Diferenciación floral 2. Reguladores de crecimiento. Inducción, Iniciación y Diferenciación floral

14 Inducción Estimulo ambiental incita a la floración MANGO ♦ El estímulo para IF son temperaturas bajas entre 20/15-18 °C (día/noche) en los subtrópicos. ♦ Brotes fisiológicamente maduros en el trópico. Brotes en reposo, son inducidos en “ausencia de bajas temperaturas”, MANGO ♦ El estímulo para IF son temperaturas bajas entre 20/15-18 °C (día/noche) en los subtrópicos. ♦ Brotes fisiológicamente maduros en el trópico. Brotes en reposo, son inducidos en “ausencia de bajas temperaturas”, T° Estímulo Nuñez-Elisea y Davenport, 1995; Davenport, 2000; Davenport, 2007, Ramírez y Davenport; 2010

15 INICIACION FLORAL ♥ La transición de meristemo vegetativo a reproductivo. ♥ Incluye todos el desarrollo necesario para comprometer irreversiblemente al meristemo para producir una inflorescencia INICIACION FLORAL ♥ La transición de meristemo vegetativo a reproductivo. ♥ Incluye todos el desarrollo necesario para comprometer irreversiblemente al meristemo para producir una inflorescencia

16 DIFERENCIACIÓN FLORAL ♥ Proceso en el cual ocurre la formación de primordios florales en un meristemo reproductivo que ha sido iniciado. ♥ Ocurre Organización floral Maduración floral ♥ Forman las partes de la flor en este orden. Sépalos, pétalos, estambre y carpelo. (flores solitarias) En inflorescencias la formación de las partes de la flor ocurre después que se han formado los ejes secundarios y terciarios. DIFERENCIACIÓN FLORAL ♥ Proceso en el cual ocurre la formación de primordios florales en un meristemo reproductivo que ha sido iniciado. ♥ Ocurre Organización floral Maduración floral ♥ Forman las partes de la flor en este orden. Sépalos, pétalos, estambre y carpelo. (flores solitarias) En inflorescencias la formación de las partes de la flor ocurre después que se han formado los ejes secundarios y terciarios.

17 Que se necesita para floración? Reguladores del crecimiento Inhibidores de giberelinas RC en mango: Paclobutrazol PBZ Haya estimulo, inducción Adecuado proceso de diferenciación floral Condiciones inductivas Prohexadiona de Calcio (P-Ca) Manzano ( Ramírez et al., 2006) Cítricos y Aguacate ( Garner et al., 2010) Mango: No hay Trabajos en México Prohexadiona de Calcio (P-Ca) Manzano ( Ramírez et al., 2006) Cítricos y Aguacate ( Garner et al., 2010) Mango: No hay Trabajos en México

18 Promover Iniciación Diferenciación Promover Iniciación Diferenciación Asegurar y Adelantar Floración Asegurar y Adelantar Floración Ferrari y Sergent, 1996: Murti et al., 2001; Yeshitela et al., 2004; Rebolledo et al., 2008; Wilkie et al., 2008; Upreti 2013 Disminuir o retardar Crecimiento vegetativo Disminuir o retardar Crecimiento vegetativo Ferrari y Sergent, 1996: Murti et al., 2001; Yeshitela et al., 2004; Rebolledo et al., 2008; Wilkie et al., 2008; Upreti 2013

19 Sitio de acción de los inhibidores Etapa I Inhibidores de ciclasas Etapa I Inhibidores de ciclasas Etapa 2 Inhibidores de Monooxigenasas Etapa 2 Inhibidores de Monooxigenasas Etapa 3 Inhibidores de Dioxigenasas Etapa 3 Inhibidores de Dioxigenasas

20 Inhibidores de Giberelinas en la Transición Morfológica de Meristemos Vegetativos a Meristemos Reproductivos en Mango ‘Ataulfo’ ESTUDIOS EN NAYARIT OBJETIVO Determinar el papel de inhibidores de giberelinas, paclobutrazol y prohexadiona de calcio, en la transición de meristemos vegetativos a reproductivos en Mango ‘Ataulfo’ OBJETIVO Determinar el papel de inhibidores de giberelinas, paclobutrazol y prohexadiona de calcio, en la transición de meristemos vegetativos a reproductivos en Mango ‘Ataulfo’

21 1 Aplicaciones repetidas de P-Ca (500 mg·L -1 ), 30+45+60 días después de la poda (ddp). 2 Una aplicación de 2500 mg·L -1 de PBZ, 30 (ddp) 3 Testigo. Agua + surfactante Se seleccionaron brotes vegetativos del flujo de verano (después de poda). Seis árboles TRATAMIENTOS Huerto alta Densidad (1333 árboles/ha) Seto

22 MUESTREOS Cuatro yemas apicales bisemanalmente (septiembre-noviembre) semanalmente (diciembre hasta inicio de brotación floral). Avitia, 1996 Eliminó la mayoría de escamas Fijadas en FAA Incluyeron en parafina Cortes en micrótomo Observaron al microscopio

23 A mva pf ta mm B es A. Estadio 1. Meristemo vegetativo apical (mva) en forma de cúpula y con primordios foliares (pf). B. Yema de forma puntiaguda con escamas (es) completamente cerrada. es B A m A.Estadio 2, iniciación floral, ligero alargamiento del meristemo apical con presencia de meristemos (m) en las axilas de las brácteas. B.B. Yema ensanchada en la base con ligera apertura de escamas (es) en el ápice. Se estableció una escala de cuatro estadios

24 Estadio 3. Alargamiento del eje principal de la inflorescencia (raquis) (epi) y formación de protuberancias meristemáticas (pm) de ejes secundarios en ápice y desarrollo de ejes secundarios (es) en la base con protuberancias meristemáticas (pm) de ejes terciarios. B. Externamente, yema hinchada de forma redonda con escamas (es) completamente separadas. Estadio 4. Eje secundario presentando alargamiento de ejes terciarios de la inflorescencia (eti) y la formación de meristemos reproductivos (mr), asi como el desarrollo de primordios de sépalos(ps), pétalos (pp) estambres (pe). B. Externamente la inflorescencia emerge entre las brácteas. epi pm es A B

25 A B Temperatura, precipitación (A) y desarrollo de yema en brotes apicales (B) 2013-2014 RESULTADOS

26 PBZ P-Ca Testigo Porcentaje de yemas diferenciadas (Estadio 4) ocho días antes de inicio a floración. La fecha corresponde al momento en que se presentó E4. Porcentaje de yemas diferenciadas (Estadio 4) ocho días antes de inicio a floración. La fecha corresponde al momento en que se presentó E4.

27 A B Temperatura y precipitación (A) y desarrollo de yema en brotes apicales de mango (B) 2014-2015

28 PBZ P-Ca Testigo Porcentaje de yemas diferenciadas (E4) ocho días antes de inicio a floración. La fecha corresponde al momento en se presentó E4

29 Porcentaje de floración en árboles tratado con reguladores de crecimiento

30 Los inhibidores de giberelinas aseguran floración. Independientemente de las condiciones no inductivas.

31 Dinámica de la floración de árboles de mango del cultivar Ataulfo. 2008 Resultados en campo con PBZ….. 0.5 a 1 g i.a./m de diámetro de copa

32 Edad del huerto (años) Producto y dosis (ml/árbol) Floración (%) DAF*Cosecha (kg/árbol) DAC** 12A 20983264-7630 Sin sombrearC 20983279-8430 Testigo70-48-54- Presencia de mango niño 18A 30703538-6430 Mod. Som.C 30703542-5630 Testigo20-6-10- Presencia de mango niño < del 10 % DAF*= Días de adelanto de floración, DAC**=Días de adelanto de cosecha Huertos de validación en el cultivar Ataulfo. Compostela 2009

33 Tratamiento2009201020092010 Época de floración y Adelanto (Días) x Época de floración y Adelanto (Días) x Intensidad de floración (%) PBZ z 40262815 89.6 a w 98.1 a PBZ + KNO 3 2937202372.0 a93.6 a Testigo66-43-50.6 b64.4 b DMS33.816.4 CV16.728.7 Época de floración de árboles de mango cv. Manila 20 – 10 ml de Austar por árbol

34 Dosis (mg·L -1 ) Época de aplicación (DDP) z 30 y 4560 150P-Ca 500P-Ca 2500 PBZ 1500P-Ca Testigo x Efecto de P-Ca en brotación floral de ‘Ataulfo’ z DDP= Días después de la poda y Brotes entre 5-10 cm de longitud x Aplicado con agua y surfactante (1 ml∙L -1 de agua) Verano 2013 Alternativa a PBZ P-Ca? Alternativa a PBZ P-Ca?

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36 Tratamiento Número de días a floración (DDA) z Adelanto (Días) InicioPlena P-Ca 150 (3X)141 a161 a9 P-Ca 500 (3X)125 ab150 ab20 PBZ 2500 (1X)117 b145 b25 P-Ca 1500 (1X)110 b135 b35 Testigo142 a170 a CV12.068.67 Número de días a floración y adelanto en árboles de ‘Ataulfo’ 2014 Z DDA; Después de la última aplicación de P-Ca

37 Porcentaje de floración en árboles de mango ‘Ataulfo’. 2014

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39 3. Genes Relacionados con el Proceso de Floración

40 Arabidopsis thaliana Es una pequeña planta familia de las crucíferas. Importante estudiar muchos aspectos de la biología molecular de las plantas. Genoma ♦ 125 mill de pb ♦ 25,500 genes ♦ 70 % (función) Genes de floración Cuatro Rutas para Floración

41 Fotoreceptores 1. Días largos permiten la acumulación de un factor de transcripción 2. CO controla la expresión del gen Flowering Locus (FT) en la hoja 3. Transcriptor FT se traduce en Proteína FT 4. La proteína FT se mueve a través del floema al meristemo apical 5. FT interactúa con el factor de transcripción 6. El complejo FT, FD activan genes como AP1 para iniciar floración 7. LEAFY (LFY) es un factor de transcripción requerido para la expresión de AP1 8. La expresión de LFY esta regulado por FT Cuatro rutas para floración Cuatro rutas para floración

42 Mandarina ‘Satsuma’ Niveles de mRNA homólogo de FT en inducción floral. ‘Moncada’ Genes de floración afectados Carga de fruto Mandarina ‘Satsuma’ Niveles de mRNA homólogo de FT en inducción floral. ‘Moncada’ Genes de floración afectados Carga de fruto Hibrido transgénico Citrus sinensis L. La sobre expresión LEFY y AP1 disminuye la fase juvenil Floración (bajo control ambiental y endógeno) Hibrido transgénico Citrus sinensis L. La sobre expresión LEFY y AP1 disminuye la fase juvenil Floración (bajo control ambiental y endógeno) Naranja y Vid Ortólogos de LEAFY actúan como promotores florales Naranja y Vid Ortólogos de LEAFY actúan como promotores florales Peña et al., 2001, Endo et al., 2005; Boss et al., 2006; Sreekantan; Thomas, 2006; Kotoda et al., 2006, 2010; Mimida et al., 2009 Arabidopsis Genes Homólogos de la identidad del meristemo floral de Arabidopsis fueron encontrados en Frutales ‘Jonathan’ Dos homólogos LEAFY AFL1 y AFL2 La expresión de AFL1 en el meristemo comenzó en la transición de vegetativo a reproductivo ‘Jonathan’ Dos homólogos LEAFY AFL1 y AFL2 La expresión de AFL1 en el meristemo comenzó en la transición de vegetativo a reproductivo Diferentes nombres en diferentes especie pero la misma función

43 Arboles de Irwin 2 años de edad Arboles de Irwin 2 años de edad Temperaturas Inductivas 15°C No inductivas 25°C Diferentes tejidos Hoja Yema apical Raquis de Inflores. Ejes secundarios Flores hermafroditas pulpa Nakagawa et al. 2012 Mango MiFT Expresado en hojas maduras de árboles expuestos a bajas temperaturas (15°C) MiFT Expresado en hojas maduras de árboles expuestos a bajas temperaturas (15°C) MiFT es señal de la floración en mango

44 Muestrearon hojas y yemas apicales 1, 30 y 90 DDA. Muestrean brotes Cada mes (Oct 2009 – Feb 2010) Hojas y yema apical para genes Muestrean brotes Cada mes (Oct 2009 – Feb 2010) Hojas y yema apical para genes Arboles de Irwin 10 años de edad Arboles de Irwin 10 años de edad Arboles sin producción Arboles con producción eliminaron la fruta Poda de arboles Cosecha agosto 2009 Noviembre 2009: 15 brotes/árbol AG 3 (200 mg·L -1 ) Noviembre 2009: 15 brotes/árbol AG 3 (200 mg·L -1 ) Muestras en N-líquido, almacenadas a -80°C

45 Fig. 4. Expression levels of MiFT, MAP1, and MLFY in mango leaves and apical buds. MiFT expression was measured in the leaves, while MAP1 and MLFY expression was measured in the apical buds Árboles NC (floración) Árboles HC (muy poca) Árboles NC (floración) Árboles HC (muy poca) Expresión MiFT incrementó solo en árboles alternantes. La expresión esta regulada por carga de fruta y temperatura Expresión MiFT incrementó solo en árboles alternantes. La expresión esta regulada por carga de fruta y temperatura La aplicación de 250 ppm de AG 3 inhibió la expresión de MiFT en ambos árboles. Floración La aplicación de 250 ppm de AG 3 inhibió la expresión de MiFT en ambos árboles. Floración Resultados

46 Fig. 4. Expression levels of MiFT, MAP1, and MLFY in mango leaves and apical buds. MiFT expression was measured in the leaves, while MAP1 and MLFY expression was measured in the apical buds Expresión MAP1 incrementó en árboles alternantes bajo temperaturas frías (15°C). 9 10 11 12 1 2 MAP1 se expreso en yemas apicales fue mayor en árboles alternantes que no alternantes

47 NAYARIT Noviembre 2013 1, 30 y 90 DDA Noviembre 2013 1, 30 y 90 DDA Muestreo brotes Cada mes: Septiembre Hojas y yema apical Ubicación: O, P y N Muestreo brotes Cada mes: Septiembre Hojas y yema apical Ubicación: O, P y N 4. AG 3 250 mgL -1 Muestras almacenadas a -80°C Arboles de ‘Ataulfo’ 8 años de edad Arboles de ‘Ataulfo’ 8 años de edad Tratamientos 1.P-Ca, 500 mg·L -1 3X 2.PBZ 2500 mg·L -1 1X 3.Testigo Tratamientos 1.P-Ca, 500 mg·L -1 3X 2.PBZ 2500 mg·L -1 1X 3.Testigo Después de cosecha Poda de arboles. 2013 Después de cosecha Poda de arboles. 2013 Expresión de genes: MiFT MAP1 MiGA20-ox Tipo de brote emergido En época de floración

48 PCR Tiempo Real NanoDrop

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50 PBZ Expresión de MiFT en hojas de mango Ataulfo tratadas con PBZ

51 Efecto del PBZ y orientación en el tipo de crecimiento emergido en el período de floración. Cv Ataulfo BF, brote floral; BV, brote vegetativo; BI, brote inactivo O, lado oriente; P, poniente; N. norte

52 Expresión de MiFT en hojas de mango Ataulfo tratadas con Reguladores de crecimiento

53 Tipo de crecimiento emergido en el período de floración. I, Inflorescencia; V, brote vegetativo; IN, Inactivo. 2014

54 Conclusiones 1 Nayarit, alta humedad y ausencia de temperaturas frías (≤20°C), crecimiento vegetativo, floración irregular Inhibidores de síntesis de giberelinas, PBZ aseguran y adelantan floración 2 Inhibidores de síntesis de giberelinas (PBZ), reducen el tiempo del proceso de diferenciación floral. Se logra mayor porcentaje de yemas diferenciadas. Prohexadiona de calcio (P-Ca) pudiera ser un sustituto de PBZ 3 En huertos alta densidad, sin el uso de inhibidores de giberelinas, el inició de diferenciación ocurrió de 1 a 1.5 meses más tarde y hay menor % de yemas diferendiadas

55 4 La iniciación floral en ‘Ataulfo’ ocurrió con temperaturas entre 27-30/15-17 °C (día/noche) y en brotes con dos a cuatro meses de edad 5 Bajo condiciones de trópico, edad y temperatura son importante en Inducción y diferenciación 6 MiFT es el gen de la señal de floración en mango MiFT esta regulado por inhibidores de giberelinas: PBZ, P-Ca GAs bloquean la expresión de MiFT, inhibiendo floración Falta Estudios MiAP1 MiGA20-ox Falta Estudios MiAP1 MiGA20-ox

56 XVII Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Ciencias Hortícolas, A.C. Y 3er Congreso Internacional Nuevo Vallarta, Nayarit, 2017 La horticultura en la mitigación y adaptación al cambio climático