1 Efecto del Óxido Nítrico Ambiental sobre el el Metabolismo Oxidativo en SorgoSusana Puntarulo Fisicoquímica-PRALIB, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires

2 Características fisicoquímicas del óxido nítricoespecie paramagnética, gaseosa, pequeña y neutra NO: KK (sg2s)2(su2s)2(pu2p)4(sg2p)2(pg2p)1 radical libre (e- desapareado) pequeño tamaño fácil difusión reactivo frente a otros radicales y frente a metales de transición

3 Síntesis de óxido nítrico en plantasNO3- NO2- PM-NR membrana plasmática Ni-NOR L-arg NO2- no enzimática NOS-like NO citosol pared celular NR NO3- NO2- NOS-like NO2- L-arg L-arg CTE mitocondria NOS-like L-arg NOS-like cloroplasto peroxisoma

4 Síntesis de óxido nítrico en plantasenzima nitrato reductasa (NR) NO2- citosol Km=60 μM Km=100 μM constitutiva NO3- NR NO inducible (luz, nitrato) NAD(P)H NAD(P)H+ enzimas con actividad de NO sintasas (NOS-like) citosol L-arginina + O L-citrulina + NO NOS organelas NAD(P)H NAD(P)H+ inhibición (análogos L-arg)

5 Efectos del óxido nítrico en plantasmecanismos de acción del NO estímulo ABA, auxinas, CK, GA [GMPc] [NO] GMPc-PK etileno [ADPRc] MAPK [Ca2+]cit fitocromos procesos mitóticos muerte celular inducción de genes procesos regulados por Ca2+ procesos mediados por luz

6 Efectos del óxido nítrico en plantasasociados a procesos fisiológicos vinculados a situaciones de estrés formación de raíces sequía activación del ciclo celular metales pesados cierre de estomas salinidad inducción de la germinación daño mecánico retardo de la senescencia radiación UV homeostasis del Fe infección por patógenos

7 Fuentes exógenas de NO NO atmosférico: NO+NO2+N2O (260 x109 kg/año) NO en suelos es un producto secundario de procesos de nitrificación y denitrificación (20% del contenido atmosférico)

8 Generación de NO dependiente de NO2- en cloroplastoscloroplastos desnaturalizados cloroplastos + DCMU estroma tilacoides 3380 3400 3420 3440 3460 3480 Gauss Generación de NO (nmol min-1 mg-1 prot) Cloroplastos Cloroplastos + calor Cloroplastos + DCMU Estroma Tilacoides 3,2±0,2 nd 1,2±0,2* nd 2,7±0,3 Generación de NO (nmol min-1 mg-1 prot) NO2- (μM)

9 Efectos del NO sobre lípidos y proteínas de cloroplastosGSNO 0,5 mM GSNO 0,25 mM GSNO 0,1 mM GSNO 0,05 mM NO (μM) Tiempo (min) oxidación de proteínas oxidación de lípidos * * * Intensidad (UA calle-1) POBN-RL (nmol mg-1 prot) 0,10 0,25 0,50 0,05 0,10 0,25 0,50 GSNO (mM) GSNO (mM)

10 NO en cloroplastos de hojas de sojaLos cloroplastos son capaces de sintetizar NO empleando tanto NO2- como L-arginina. La suplementación de cloroplastos con NO produjo una disminución del daño oxidativo a lípidos y proteínas. Jasid S, Simontacchi M, Bartoli CG, Puntarulo S (2006) Chloroplasts as a nitric oxide cellular source. Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins. Plant Physiol 142:

11 Germinación de semillas de sorgoincubación a 26ºC oscuridad solución nutritiva Sorghum bicolor I II III 100 80 60 40 20 Germinación (%) (●) 100 80 60 40 20 PF (mg semilla-1) (○) 12 h 48 h 24 h 0 h 36 h 48 36 24 12 Tiempo de incubación (h)

12 Metabolismo oxidativo de embriones en desarrollo* * * * Oxidación de DCFH (UA min-1 g-1 PF) POBN-RL (nmol g-1 PF) * Tiempo de incubación (h) Tiempo de incubación (h) Defensas antioxidantes en embriones en desarrollo Tiempo (h) AH- (nmol g-1 PF) Tioles (μmol g-1 PF) α-TOH (nmol g-1 PF) γ-TOH (nmol g-1 PF) 24 36 48 147±14 103±16 95±10* 1,58±0,18 1,25±0,14 0,77±0,09* 3,33±0,13 2,46±0,67 2,74±0,33 10,0±0,3 3,4±1,2* 0,75±0,16*

13 Detección de NO en embriones en desarrolloaN espectro simulado GSNO embriones 24 h embriones 48 h 3350 3400 3450 3500 Gauss * * * * MGD2-Fe2+-NO (nmol g-1 PF) MGD2-Fe2+-NO (nmol g-1 PF) * 25 12 4 Tiempo de incubación (h) NO3- (mM)

14 Generación de NO en embriones en desarrollogeneración de NO dependiente de NO2- 10 NO2- y NADH 8 6 NO3- y NADH Altura de la señal (103) 4 preincubación NaN3 2 control 2 4 6 8 10 Tiempo de reacción (min) * * actividad de NR * NO2- (nmol h-1 mg-1 prot) * embriones h Tiempo de incubación (h)

15 Generación de NO en embriones en desarrollogeneración de NO dependiente de L-arginina 15 12 L-arginina y NADH 9 Altura de la señal (102) 6 preincubación L-NAME 3 control 2 4 6 8 10 Tiempo de reacción (min) * actividad de NOS-like * * Formazan (nmol h-1 mg-1 prot) * embriones h * Tiempo de incubación (h)

16 Efectos del NO en embriones de sorgo en desarrolloincubación a 26ºC 24 h en oscuridad dadores de NO Sorghum bicolor SNP DETA NONOato

17 Efectos del NO sobre el crecimiento de los embrionesH2O SNP 1 mM SNPf 1 mM DETA NONOato 1 mM 3350 3400 3450 3500 Gauss MGD2-Fe2+-NO (nmol g-1 PF) PF (mg embrión-1) PS (mg embrión-1) H2O SNP 0,01 mM SNP 0,1 mM SNP 1 mM SNPf 1 mM 2,5±0,4 3,1±0,4 4,6±0,6* 6,0±0,8* 2,5±0,6 6,8±0,6 8,4±0,8 10,0±0,5* 10,8±0,6* 6,6±0,3 0,88±0,06 1,05±0,09 1,13±0,06* 1,23±0,07* 0,85±0,06

18 Efectos del NO sobre el metabolismo oxidativoOxidación de proteínas (kDa) 80,0 * 49,1 Oxidación de DCFH (UA min-1 g-1 PF) 34,5 28,9 20,6 0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 SNP (mM) MPM SNP (mM) * * Conductancia relativa (%) POBN-RL (nmol mg-1 prot) 0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 SNP (mM) SNP (mM)

19 Detección de la deposición in situ de O2-H2O SNP 0,1 mM SNP 1 mM Formación de nitrotirosinas proteicas (kDa) * 80,0 * 49,1 Intensidad (UA calle-1) 34,5 28,9 20,6 0,01 0,1 1 0,01 0,1 1 MPM SNP (mM) SNP (mM)

20 Efectos del NO sobre el metabolismo del FeH2O SNP 1 mM SNPf 1 mM DETA NONOato 1 mM 1200 1400 1600 1800 2000 Gauss Fe total (μmol g-1 PF) DF-Fe3+ citosol (nmol mg-1 prot) H2O SNP 0,01 mM SNP 0,1 mM SNP 1 mM K4[Fe(CN)6] 1 mM 0,36±0,06 0,39±0,04 0,37±0,08 2,5±0,2 2,8±0,3 3,1±0,2 6,0±0,4* 3,1±0,4

21 Efectos del NO durante el desarrollo post-germinativo de embriones de sorgoLos embriones de sorgo en desarrollo fueron capaces de incorporar NO proveniente del medio de imbibición. El NO resultó beneficioso para el desarrollo de los embriones previniendo la formación de especies oxidantes, y presentando un papel protector frente al daño oxidativo a macromoléculas. La exposición de los embriones in vivo a NO parece presentar una doble función: incrementar la disponibilidad de Fe sin cambios en los niveles de Fe total, y prevenir su toxicidad, probablemente por formación de complejos de Fe-NO.