1 ELEKTROFOREZA Technika rozdzielania o zastosowaniach analitycznychprof. M. Kamiński GDAŃSK 2014 Elektroforeza – technika analityczna, rzadziej preparatywna, stosowana w chemii i biologii molekularnej, zwłaszcza w genetyce. Jej istotą jest rozdzielenie mieszaniny związków chemicznych na możliwie jednorodne frakcje przez wymuszanie wędrówki ich cząsteczek w polu elektrycznym. Cząsteczki różnych substancji różnią się zwykle ruchliwością elektroforetyczną. Parametr ten jest w przybliżeniu wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki. Istnieje wiele wariantów tej techniki. W zależności od ośrodka, w którym następuje rozdział, wyróżnić można elektroforezę bibułową (dziś już przestarzałą i praktycznie niestosowaną), żelową (GE) i kapilarną (CE).

2 Warto zapoznać się z opracowaniem obecnym w Internecie oraz ze skrótem w WIKIPEDIA

3

4

5

6

7 Elektroforezą nazywa się procesy elektrokinetyczne zachodzące w objętości elektrolitu i polegające na przemieszczaniu się jonów i makro-jonów w polu elektrycznym. W klasycznym ujęciu elektroforezy, opracowanym dla koloidów, mowa jest o ruchu fazy rozproszonej w stosunku do fazy rozpraszającej pod wpływem pola elektrycznego. Zjawisko to opisane zostało przez Smoluchowskiego i Sterna w początkach XX w. Do tej pory do zjawiska elektroforezy włączono ruch wszelkich jonów poddanych działaniu pola elektrycznego w tym środowisku. Zarówno proste jony jak i makro-jony w środowisku wodnym występują w postaci uwodnionej, co oznacza, że posiadają otoczkę hydratacyjna, będącą w istocie rzeczy uporządkowanym układem dipoli wodnych związanych z jonem dość słabymi siłami oddziaływania elektrostatycznego. Zasięg tego uporządkowania, choć niewielki, to w całkiem poważny sposób wpływa na możliwość ruchu jonów i makro-jonów w otaczającym środowisku, a właściwości otoczki hydratacyjnej zależą zarówno od rozmiaru jonu i zgromadzonego na nim niezrównoważonego ładunku elektrycznego, jak i od właściwości elektrolitu, tj. jego siły jonowej oraz wartości pH. W elektroforezie żelowej ośrodkiem, w którym przemieszczają się badane substancje, jest żel elektroforetyczny sporządzony z agarozy, poliakrylamidu[a], agaru lub skrobi (metoda historyczna), uformowany w płytkę o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu centymetrów i grubości od ułamka do kilku milimetrów (w rzadszej elektroforezie dyskowej jest to słupek). Kroplę analizowanej mieszaniny nanosi się do tak zwanej studzienki, czyli zagłębienia w żelu. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (na przykład w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody, do których przykłada się stałe lub asymetryczne pulsujące napięcie elektryczne o wartości od 50 do 3000 woltów. Ze względu na zróżnicowaną mobilność elektroforetyczną ruchliwsze (zazwyczaj mniejsze) cząsteczki oddalają się szybciej od miejsca naniesienia próbki. Przebieg elektroforezy można monitorować, nanosząc (na osobnych ścieżkach lub razem z preparatem) specjalne barwniki (tak zwane markery) o znanej mobilności elektroforetycznej.

8 Siła jonowa - jest funkcja steżenia jonów komponujacych elektrolit (bufor), a jej wartość definiuje się jako połowę sumy iloczynów steżen molowych i kwadratu wartosciowosci wszystkich jonów znajdujących się w roztworze W poczatkowej fazie wzrostu wartości siły jonowej, gdy odległości pomiędzy jonami, a scislej pomiędzy otoczkami jonów są duże, obserwuje się wzrost przewodnosci jonowej elektrolitu zwiazany ze wzrostem liczby nośników ładunku elektrycznego. Jednak dalszy wzrost siły jonowej prowadzi do tak dużego zageszczenia jonów i ich otoczek hydratacyjnych, że decydujaca role w ich ruchu w polu elektrycznym zaczyna odgrywac tarcie wystepujace pomiędzy otoczkami. Przewodnictwo elektryczne elektrolitu w tych warunkach znacznie spada. Z tego powodu niezmiernej wagi nabiera odpowiedni skład elektrolitów przeznaczonych do elektroforezy. Przy zbyt wysokim steżeniu jonów nastepuje ograniczenie ich ruchliwosci, przy zbyt niskim można zaobserwować niedobór nośników ładunku elektrycznego i zwiazany z tym wzrost oporności elektrycznej. Aminokwasy, peptydy i białka mogą być zarówno zasadami, jak i kwasami. W związku z tym, wypadkowy ładunek elektryczny cząsteczki zależy od wartości pH i można znaleźć taka jej wartość przy której wypadkowy ładunek równy jest zeru. Te wartość pH nazywa się punktem izoelektrycznym i oznacza symbolem pI. Każdy tego rodzaju związek chemiczny charakteryzuje się jemu właściwym punktem izoelektrycznym. Zawsze w środowisku o pH < pI aminokwas obdarzone jest ładunkiem dodatnim i migruje w kierunku elektrody ujemnej. Aby elektroforetyczna separacja aminokwasów była skuteczna koniecznym jest utrzymywanie stałej wartości pH elektrolitu. Jednak z uwagi na zachodzącą elektrolizę wody ciągle generowane są jony H+ na katodzie i OH- na anodzie. W związku z tym elektrolit przeznaczony do elektroforezy musi być buforowany.

9 Parametry elektryczne - Zjawisko elektroforezy zachodzi dzięki obecności pola elektrycznego. Siła, z jaka pole to oddziałuje na ładunek elektryczny jonu jest proporcjonalna do natężenia tego pola (E [V/m]), a ta wielkość jest z kolei proporcjonalna do napięcia U [V] przyłożonego do elektrod. W zakresie niskich sił jonowych istnieje prosta relacja wynikająca prawa Ohma regulująca zależność pomiędzy przyłożonym napięciem U, a płynącym w wyniku tego prądem I [A] oraz oporem elektrycznym (rezystancja) R [C] elektrolitu: V = I R. Podczas przepływu prądu elektrycznego, w wyniku wykonywania pracy przesunięcia ładunku elektrycznego przez pole, na opornościach obwodu tracona jest moc P [W]. Pracy tej towarzyszy wydzielanie się ciepła, zwanego ciepłem Joule’a. Ilość wydzielonego ciepła Q [J] można obliczyć korzystając z równania: Q = U I t. Oczywiście ciepło to jest wydzielane na wszystkich oporach obwodu, ale największy udział w tym zjawisku posiada elektrolit. Zasilacze stosowane do elektroforezy zwykle mogą utrzymywać stała wartość jednego z parametrów: prądu I, napięcia U lub mocy P. Dla pozostałych parametrów ustala się tylko górny limit wartości. W ciągu trwania elektroforezy oporność elektrolitu ulega zmianom. zwykle obniża się ze wzrostem temperatury wynikającym z ciepła Joule.a. W zależności od składu elektrolitu oraz wyboru stabilizowanego parametru obserwuje się wzrost lub spadek ilości wydzielanego ciepła. I tak przy stałym prądzie wzrasta oporność układu i wraz z tym wzrasta ilość wydzielanego ciepła. Układ wymaga aktywnego odprowadzania ciepła. Z drugiej strony, gdy stabilizowane jest napięcie, ze wzrostem oporu następuje ograniczenie prądu, a w ślad za tym spadek ilości oddawanego ciepła. Układ nie wymaga termostatowania, ale znacznie wydłuża się czas trwania elektroforezy. W przypadku elektroforezy w warunkach stałego pH i stabilizacji prądu, wraz ze spadkiem oporności układu maleje ilość oddanego ciepła. W tych samych warunkach elektrolitu przy stabilizacji napięcia rośnie wartość prądu i w związku z tym wzrasta ilość wydzielanego ciepła. Wybór optymalnego składu elektrolitu (buforu) oraz stabilizacji wybranego parametru musi być poprzedzony analiza licznych zmiennych, w tym czasu trwania elektroforezy, ograniczenia dyfuzji molekuł czy strat aktywności biologicznej molekuł.

10 Rodzaje nośników elektroforetycznych Nośniki elektroforetyczne - Rozdziały elektroforetyczne mogą być prowadzone bezpośrednio w objętości elektrolitu, rozwiązanie takie stosowane jest często w elektroforezie kapilarnej, lub w nośniku elektroforetycznym wypełnionym odpowiednim elektrolitem. W tym drugim przypadku nośnik elektroforetyczny (bibuła, azotan celulozy, agaroza, poliakrylamid i inne) nie tylko stabilizuje elektrolit ale często przyczynia się do lepszej separacji makrocząsteczek. Szczególnie zastosowanie porowatych nośników (agarowa, poliakrylamid) potęguje efekt separacji poprzez dodatkowe frakcjonowanie makrocząsteczek na zasadzie sita molekularnego. Przy poszukiwaniu nowego rodzaju nośnika należy zawsze pamiętać, że powinien on być elektrycznie obojętny. Występowanie związanego z nośnikiem ładunku elektrycznego prowadzi do niekontrolowanych oddziaływań makrojonów z tym ładunkiem i w rezultacie zmianę prędkości ich migracji, aż do całkowitego zatrzymania makrojonu. Jednocześnie istnienie takiego ładunku elektrycznego przyczynia się do migracji cząsteczek wody w kierunku katody. Proces ten nazwano elektroendoosmoza. Generalnie istnienie związanego z powierzchnia nośnika ładunku elektrycznego prowadzi do znaczącego obniżenia rozdzielczości elektroforezy. Rodzaje komór elektroforetycznych Ze względu na sposób umieszczenia nośnika elektroforetycznego można wyróżnić elektroforezę kapilarna (ang. capillary electrophoresis), elektroforezę pionowa (ang. vertical electrophoresis) oraz elektroforezę pozioma (ang. horizontal electrophoresis).

11 Elektroforeza pionowa - jest najpowszechniej stosowna technikaElektroforeza pionowa - jest najpowszechniej stosowna technika. W technice tej nośnik elektroforetyczny wypełnia szklane rurki (elektroforeza rurkowa) lub znajduje się pomiędzy dwoma płytkami rozdzielonymi przekładkami dystansowymi (ang. spacer) (elektroforeza płytowa). Elektroforeza pozioma - jest rodzajem elektroforezy w którym nośnik umieszczony jest w płaszczyźnie poziomej. Zaleta tego rozwiązania jest brak wycieków elektrolitu oraz możliwość łatwego odprowadzenia ciepła generowanego w trakcie przepływu prądu. Elektroforeza półsucha, w której bufory elektrodowe zamknięte są w zestalonej agarozie lub w warstwach bibuły filtracyjnej, pozwala ponadto na znaczne ograniczenie zużycia chemikaliów niezbędnych do przygotowania buforów. Rodzaje metod elektromigracyjnych Metody elektromigracyjne stosowane w praktyce są pochodnymi lub kombinacja trzech podstawowych rodzajów separacji. Sa to: elektroforeza strefowa (ang. Zone electrophoresis), izotachoforeza (ang. isotachphoresis) oraz ogniskowanie izoelektryczne (ang. isoelectric focusing). Barwienie, dokumentacja oraz analiza ilościowa i jakościowa Ukończenie rozdziału elektroforetycznego czy transferu nie kończy procedury separacji. Większość białek i kwasów nukleinowych nie jest widoczna w świetle białym. Niezbędne jest ich wybarwienie (wizualizacja) w żelach lub na membranach, tak aby uzyskać informacje o dystansie ich migracji i ich ilości w prążku lub spocie (obszarze zawierającym białko w rozdziale 2D). Postępowanie to pozwala na przeprowadzenie analizy jakościowej i ilościowej separowanych makrocząsteczek.

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26 Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym DODATEK Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym Żele poliakrylamidowe są polimerami akrylamidu i bis-akrylamidu, a od ich proporcji zależy gęstość żelu oraz wymiary porów. Gęstość żelu dobiera się w zależności od wielkości analizowanych cząsteczek (tj. w zależności od ich masy cząsteczkowej). W przypadku wysoko - cząsteczkowych białek do rozdziału używa się żeli o niższej gęstości, zaś białka nisko-cząsteczkowe rozdziela się w żelach bardziej gęstych. W żelach 8% możliwe jest rozdzielanie cząsteczek o wielkości od 24 kDa do 205kDA, żele 10% stosuje się do rozdzielania cząsteczek o masie od 14kDa – 205 kDa, a żele 12% do rozdziału kDa cząsteczek [9]. by Michał Sobkowski - Praca własna, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid= Fragment żelu poliakrylamidowego z oligonukleotydami analizowanymi w świetle UV. Elektroforeza przebiegała od góry ku dołowi. Poszczególne ścieżki obrazują proces przyłączania barwnika fluorescencyjnego, co zmieniało mobilność oligomerów i ich właściwości spektroskopowe. BP, XC – markery długości Ścieżki A–C: absorpcja przy 254 nm D: fluorescencja przy 366 nm

27 Elektroforeza w obecności SDSDo rozdziału białek najczęściej stosuje się elektroforezę w obecności SDS tj. siarczanu dodecylu sodu (tzw. SDS-PAGE). SDS jest substancją powierzchniowo czynną, która przyczynia się do poprawy rozdzielczości danej techniki elektroforetycznej. Zastosowanie siarczanu dodecylu sodu podczas rozdziału przynosi wiele korzyści, ponieważ  większość białek jest rozpuszczalna w elektrolitach zawierających SDS (a szczególnie takie po redukcji mostków disiarczkowych), a ponadto separacja (rozdział) białek odbywa się zgodnie z ich masami cząsteczkowymi. Należy również dodać, że barwienia kompleksów tworzonych przez białko i SDS jest znacznie wydajniejsze niż barwienie samego białka, a dodatkowo obecność SDS skutecznie eliminuje enzymatyczną degradację białek w trakcie ich separacji [4], [1]. SDS nadaje polipeptydom ładunek ujemny, dzięki czemu moga one migrować w polu elektrycznym. Ilość związanego SDS przez białko jest prawie zawsze liniowo zależna od masy danego polipeptydu, co z wykorzystaniem markera masy umożliwia wyznaczanie masy rozdzielanych białek [1]. SDS powoduje zrywanie prawie wszystkich wiązań niekowalencyjnych w białku, co w konsekwencji prowadzi do rozfałdowania się łańcucha polipeptydowego [6].

28 Elektroforeza natywnaTen rodzaj elektroforezy prowadzi się w poliakrylamidzie, w warunkach, w których makrocząsteczki pozostają niezdenaturowane, dzięki czemu możliwe jest odzyskanie cząsteczek białkowych w stanie pełnej aktywności biologicznej. Próbka nałożona na żel rozpuszcza się w buforze, który nie powoduje denaturacji zawartych w niej białek. Elektroforeza natywna jest przeciwieństwem elektroforezy przeprowadzanej w obecności czynników denaturujących (np. SDS).  Wadą metody jest słaba rozdzielczość [7], [9].  W celu rozdziału białek w zależności od ich masy cząsteczkowej, próbkę przed nałożeniem na żel należy zredukować w odpowiednim buforze (tzw. buforze redukującym) oraz odpowiedniej temperaturze. Związkami redukującymi (w buforach redukujących) najczęściej są: - merkaptoetanol oraz DTT (ditiotreitol), związki te przecinają (redukują) mostki disiarczkowe (S-S) pomiędzy białkami.  Elektroforeza zachodzi najefektywniej, gdy objętość próbki nakładanej na żel nie przekracza 10% objętości ścieżki, a ilość białek nakładanych na studzienkę znajduje się w pzredziale od 1 do 50 µg. Ważne jest również, by próbka nie zawierała zbyt dużych ilości soli wystęujących w postaci zjonizowanej, ponieważ powodują one powstawanie smug na żelu podczas rozdziału oraz niejednorodność prążków[9].

29 Przygotowanie próbek do elektroforezy: Bufor do próbek (2 x stężony) - przepis wg mercka(hefera): - 0,5 M TRIS-HCl o pH 6,8 (stężenie końcowe 0,125 M) - 4% SDS (siarczan dodecylu sodu) - 20 %glicerol - bromofenol blue (dodawać kroplami do uzyskania odpowiedniego granatowego koloru)  Bufor do elektroforezy (5x stężony) : - 25mM Tris - 192 mM glicyna - 0.1% SDS (pH 8.3) Wykonanie: Badane białko (1ng-50µg) zawiesić w buforze do próbek. Docelową objętość jaka ma być nałożona na studzienkę (około µl) należy  podzielić na pół:  jedną połowę stanowi bufor do próbek (stężony 2x), a drugą badana próbka rozcieńczona w odpowiedniej ilości wody, lub buforu do elektroforezy.   Tak otrzymane próbki należy zredukować, dodając  w tym celu  1% merkaptoetanol lub DTT. Redukcję próbek prowadzić przez 5 minut w temperaturze  100°C. Bezpośrednio przed naniesieniem próbek na żel, należy je odwirować celem usunięcia  wszystkich nierozpuszczonych składników. Tak przygotowane próbki można nanieść na studzienki w żelu poliakryloamidowym.  Rozdział elektroforetyczny prowadzić w buforze do elektroforezy poczatkowo przy napięciu 80V -20 minut (mniejsze napięcie ma na celu wyrównanie ładunków w żelu oraz wolniejszą migrację białek w żelu zbierającym), a następnie przy zwiększonym napięciu  (150 V przez ok. 50 minut) [9].

30 Elektroforeza nieciągłaProwadzi do jeszcze lepszych rezultatów rozdziału (separacji)  białek, a dodatkowo otrzymuje się bardzo ostre prążki, które zawierają białka charakteryzujące się taką samą ruchliwością elektroforetyczną (często interpretowane jako białka o tej samej masie cząsteczkowej) [7]. Przygotowanie żelu poliakrylamidowego do rozdziału białek Żele polakrylamidowe przygotowywane są z roztworu monomerów akryloamidu oraz z substancji sieciujących określanych często jako cross-linkers. Substancją sieciującą najczęściej jest N,N’-metylenobisakryloamid (bisakryloamid). APS (nadsiarczan amonu) stosuje się do zainicjowania chemicznej  polimeryzacji żelu , będącą  reakcją wolnorodnikową. Reakcja ta zachodzi w obecności katalizatora, którym najczęściej jest TEMED (N,N,N’,N’-tetrametyloetylenodiamina) [2], [3], [5].

31 Wykonanie Żel poliakrylamidowy przygotowuje się (wylewa) dwustopniowo: jako pierwszy przygotowuje się   żel rozdzielający o procentowości zależnej od wielkości rozdzielanych cząsteczek. W żelu rozdzielającym zachodzi  właściwy rozdział białek. Na wylany żel rozdzielający nanosi się izobutanol (w celu usunięcia ewentualnych pęcherzyków powietrza ). Dodatkowo izobutanol  zapobiega dostępowi powietrza, który utrudnia proces polimeryzacji żelu (polimeryzacja trwa od 30 do 120 minut).  Po upływie czasu polimeryzacji, należy wypłukać izobutanol z góry żelu , po czym delikatnie osuszyć go bibułą, nie dopuszczając tym samym do przesuszenia górnej warstwy żelu. Następnie,  wylewa się żel górny ( 4% ), który jest tzw. żelem zagęszczającym ( w tym żelu umieszcza się grzebień  w celu powstania tzw. studzienek) [2], [3], [5], [9]. Przygotowanie żelu rozdzielającego i zagęszczającego [9]. W skład buforu do elektroforezy wchodzi Tris-glicyna o pH=8.3, żel rozdzielający zawiera Tris-HCl ( o pH=8.8), zaś żel zatężający Tris-HCl o niższym pH= Wyższe pH w żelu rozdzielającym powoduje jonizację glicyny, w związku  zczym podczas rozdziału migruje ona tuż za jonami chlorkowymi [1].

32 ELEKTROFOREZA KAPILARNATechnika , co do której nadzieje były nadmierne, jednak możliwy jest renesans

33

34

35

36

37

38

39

40