1 Escribá MC (1,2), Villasante A (2), Goday C (1) (1) Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid (2) Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", CSIC-UAM. Madrid

2 CICLO CROMOSÓMICO DE Sciara coprophila A X L oocito meiosis femenina (ortodoxa) cigoto A X X X L L L L X célula germinal meiosis masculina A X L espermatozoide meiosis I AA XX LL AA XX meiosis II XX A L XX AA A AXA AX soma femenino X L L L soma masculino L L L X A AX XA AX X LLALLA AA XX LL A, X cromosomas maternos A, X cromosomas paternos 1 1 2 2 34 5 6 5

3 Eliminación de los cromosomas X y L en el soma embrionario Xp L

4 L P L XmXm Meiosis IMeiosis II P: cromosomas paternos M: cromosomas maternos Xm: X materno L: cromosomas L Meiosis masculina en S coprophila profase Ipro-metafase Ianafase I metafase II anafase IItelofase II XmXm xmxm PP P P M+L

5 Muy condensada Poco condensada Regiones pericentroméricas y telómeros Brazos de los cromosomas Rica en secuencias repetidas Pocas secuencias repetidas Pobre en genes Rica en genes Replica tardíamente en la fase S Replica en la fase S No recombina durante la meiosis Recombina durante la meiosis Histonas hipoacetiladas, histona H3 metilada Histonas acetiladas en la lisina 9, proteínas heterocromáticas (HP1) EUCROMATINA HETEROCROMATINA Características Heterocromatina y Eucromatina.

6 Heterocromatina del Centrómero:  Típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo que no está conservada, lo que contrasta con su función conservada.  El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias repetidas. Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos

7 Heterocromatina del Centrómero:  La heterocromatina centromérica está típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo que no está conservada, lo que contrasta con su función conservada.  El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias repetidas. Heterocromatina subtelomérica:  Las regiones subteloméricas de todos los organismos eucariotas consisten en mosaicos de repeticiones y retrotransposones estructurados de una forma notablemente similar a centrómeros. Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos

8 Heterocromatina del Centrómero:  Típicamente compuesta por satélites de rápida evolución, por lo que no está conservada, lo que contrasta con su función conservada.  El análisis comparativo de los centrómeros de: Drosophila melanogaster, vertebrados y plantas, muestra una organización común con islas de transposones embebidas en grandes regiones de secuencias repetidas. Heterocromatina subtelomérica:  Las regiones subteloméricas de todos los organismos eucariotas consisten en mosaicos de repeticiones y retrotransposones estructurados de una forma notablemente similar a centrómeros. Telómeros:  Región final del cromosoma que se requiere para completar la replicación, apareamiento meiótico, y la estabilidad del cromosoma.  La secuencia (TTNGGG)n está conservada en la mayoría de especies eucariotas.  La secuencia telomérica (TTAGGG)n se encuentra en todos los vertebrados.  Parece ser que la secuencia (TTAGG)n está restringida a los artrópodos, existiendo en la mayoría de especies de insectos, excepto en dípteros y algunos coleópteros.  Se considera que las especies de Dípteros no tienen telomerasa y en consecuencia carecen de las t í picas repeticiones teloméricas ricas en GT. Regiones heterocromáticas de los cromosomas eucarióticos

9 Genoma de S. coprophila Organización molecular poco conocida. Recientemente se han identificado, las primeras proteínas heterocromáticas (ScoHET 1 y ScoHET2). S coprophila tiene un bajo contenido en heterocromatina y ADN altamente repetido en comparación con Drosophila melanogaster (Abbott et al., 1981). Se desconocen las secuencias de ADN que conforman la heterocromatina en S. coprophila, presente en las regiones pericentroméricas, telómeros y zonas subterminales de los cromosomas del complemento regular y en los cromosomas L, exclusivos de la línea germinal y de función desconocida (1). La heterocromatina próxima al centrómero en el brazo corto del cromosoma X contienen la mayoría de las copias de los genes ribosómicos (1). 1 (Crouse, 1943; Grabrusewycz-Garcia, 1964; Eastman et al., 1980)

10 1.Importancia conocida en la segregación cromosómica (cohesión de cromátidas, centrómero). 2.Existen datos concluyentes que indican un papel importante de la heterocromatina adyacente al centrómero del cromosoma X, en la regulación de la eliminación de cromosomas X paternos en las células somáticas embrionarias, y también en la no- disyunción del cromosoma X materno durante la meiosis II masculina. En esta región heterocromática existe un elemento denominado “CE” (controlling element), que controla estos fenómenos y que es aún desconocido (Crouse et al., 1977; Crouse, 1979). ¿Por qué es de interés investigar la organización molecular de la heterocromatina en S. coprophila?

11 T70 IV X X T23 III X X X II III IV T29 T32 T23 T70 T1 H1 H2 H3 X T1 II X T32 II X X T29 IV X X (Crouse et al., 1977; Crouse, 1979)

12 1.Importancia conocida en la segregación cromosómica (cohesión de cromátidas, centrómero). 2.Existen datos concluyentes que indican un papel importante de la heterocromatina adyacente al centrómero del cromosoma X en la regulación de la eliminación de cromosomas X paternos en las células somáticas embrionarias y también en la no- disyunción del cromosoma X materno durante la meiosis II masculina. En esta región heterocromática existe un elemento denominado “CE” (controlling element), que controla estos fenómenos y que es aún desconocido (Crouse et al., 1977; Crouse, 1979). 3.Los cromosomas L (germline-limited chromosomes) son de naturaleza heterocromática, se desconoce su organización a nivel molecular y se eliminan del soma de forma idéntica a los cromosomas X. Se supone que contienen una o mas copias del elemento CE. ¿Por qué es de interés investigar la organización molecular de la heterocromatina en S. coprophila?

13 Microdissection and Cloning of DNA from a Specific Region of Drosophila melanogaster Polytene Chromosomes F. Scalenghe, E. Turco, J.E. Edström, V. Pirrotta and M. Melli (1981) Chromosoma (Berl.) 82, 205416 Cloning regions of the Drosophila genome by microdissection of polytene chromosome DNA and PCR with nonspecific primer Cedric S.Wesley, Mathew Ben, Martin Kreitman, Nabil Hagag', and Walter F.Eanes(1989) Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 3 Molecular Cloning of DNA from Specific Chromosomal Regions by Microdissection and Sequence-Independent Amplification of DNA DANIEL H. JOHNSON (1990) GENOMICS 6,243-251 Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogaster mutant Suppressor of Underreplication Yuri M. Moshkin · Stepan N. Belyakin Nikolay B. Rubtsov · Elena B. Kokoza Artem A. Alekseyenko · Elena I. Volkova Elena S. Belyaeva · Igor V. Makunin · Pierre Spierer and Igor F. Zhimulev (2002) Chromosoma 111:114–125 Molecular evolution of homologous gene sequences in germline-limited and somatic chromosomes of Acricotopus Wolfgang Staiber(2004) Genome 47: 732–741

14 Microdisección DOP PCR (Librerías de ADN) Clonaje en TOPO Secuenciación Hibridación in situ

15 Microdisección de regiones heterocromáticas del genoma de S. coprophila (C. Goday,V. Trivonov y M. Fergusson-Smith. Cambridge University. UK ) Región pericentromérica del cromosoma X y regiones teloméricas de autosomas, a partir de cromosomas politénicos de glándulas salivales.

16 Cromosomas politénicos de las glándulas salivares de S. coprophila X IV II III C C C C

17 Microdisección de regiones heterocromáticas del genoma de S. coprophila (C Goday,Vladimir Trivonov y M Fergusson-Smith. Cambridge University. UK ) Región peri-centromérica del cromosoma X y regiones teloméricas de autosomas, a partir de cromosomas politénicos de glándulas salivales. Cromosomas L enteros a partir de núcleos pre-meióticos de la línea germinal.

18 Célula de la línea germinal L

19 Microdisección de la heterocromatina del Cromosoma X DOP-PCR X

20 DOP PCR PCR al azar con el primer degenerado DOP {CCGACTCGAGNNNNNNATCTCG} Este “primer,, o iniciador contiene una mezcla de todos los cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada. Resultado: obtenemos una conjunto de secuencias correspondientes a la zona micro- diseccionada, que podrán ser clonadas.

21 Comprobación del marcaje de la genoteca mediante hibridación in situ Telómeros (5) Cromosomas L (3) Heterocromatina del cromosoma X(2) Genotecas generadas

22 Los clones obtenidos se están secuenciando y su localización en la heterocromatina se está determinando mediante experimentos de hibridación in situ sobre cromosomas politénicos y cromosomas de células germinales de S. coprophila - número de clones secuenciados: 768 - número de clones analizados por hibridación in situ: 52 - localizados en los cromosomas: 23

23 3X01 C3 (rDNA 28s) CGACTCGAGGTACATATGTGGCCGA CTCGAGGTACCAATGTGGCCGACTC GAGGTTCGTATGTGGCCGACTCGAG GGCCCTATGTGGCCGATCCGACTCG AGGGGGGGATGTAGGTCTTCTTTCC CCGCTAATTATTCCAAGCCCGTTCC CTTGGCTGTGGtTTCGCTAGATAGT AGATAGGGACAGTAGGAATCTCGTT AATCCATTTATGCGCGTCACTAATT AGATGACGAGGCATTTGGCTACCTT AAGAGAGTCATAGTTACTCCCGCCg tTTACCCGCGCTTACTTGAATTTCT TCACTTTGACATTCAGAGCACTAGG CAGAAATCACaTTGTGTCAACACCC GCTAGGGCCATCACAATGCTTtGTt TTAATTAGACAGtCgGATTCcCCag GaCCgTGCCAGTTCTGAATtAATtG TTtATtGATAATCGAACTtGATGGA AAGCcGTTAAGCCCTCtACcATCAt AGCAAGAAAGcTCCACAtCTTTG X

24 3X01 F7 (Repeticiones) CCGACTCGAGCGTGCCATGTGGTTAT TATATACGAATATTATCCTGATATTA TGCGCTTATTATACACGAAtATTATT TCGATATTATCCTGATGCGATTAATA TACACGAATATTATCTCGATGTTATC CTGATTCGATTATCATAGACGAATAT TATCTCTATATTATACTGATATTATG CGGTTATTATATACGAATATTATCTC TATATTATCCTGATGCGTTTATTGTA CACGAATATTATTTCGATATTATCCT GATTCGATTATTATACACGAATATTA TCTCGATATTATCCTGATATTATGTG GtTATCATACACGAATATTATCTCGA TATTATCCTGATATTATGCAGTTATT ATACAGGAATATTATATCGAATTATA CTGATATTATGTCGTTATTATATACG AATATTATCCTGATATTATGCGCTTA TTATACACGAATATTATCTCGATATT ATCCTGATGCGATTAATATACACGAA TATTATCTCGATGTTATCCTGATTCG ATTATCATAGACGAATATTATCTCTA TATTATACTGATATTATGCGGTTATT ATATACGAATATTATCTCTATATTAG CCACATCCTACCCTCGAGTCGGCCAC ATCGCTAACTCGAGTCGGcCACATCT TGTTCTCGAGTCGGCCACATCTTGTT CTCGAGtCGG X IV X L

25 4Tel01 F4 (Transcriptasa reversa, Ostrinia nubilalis) CCGACTCGAGGGGGAGTGTGGTCTCTAGTTCATGATC TTTTTGGTCCAACGTTCGTCCGTCCTTCTTGCAATAT GTCCCGCCCAGCTCCACTTTAAAGATGCTATTCTTTC CATGACATCAACGACCCTGGTTTGTTGTCGAATCCAT TGATTTGTCATTCTATCTCTGAGCGTAATTCCAAGCA TACTTCGTTCCATAGCTCTTTGTGCCACTCTTAATTT ATTTTCGGAAGCTTTTGTTAACGTTAACGTTTACGCT CCACATAAAGCCCTCGAGTCGG II/III C C X C IV C

26 4Tel01 F8 (Repeticiones) CCGACTCGAGATGAACATGTGGGTTTAGCACTGCTAT AGGTACTAAGGCGCAATATTCAAAAATCCTTCAGAGT GTAAAAAACTTAGAGGGCATGGCTCGGGCATGTAAAA AGTACCTTCACTAGCTATAGCAGCAAATGGTAGCCGA ATCTGTCACTTAAAAAAATGTGTCCTCCCGGCTGAAC AATAACCATACGCTATTATTATTATTATAGTAGAACC TGCAATTGGTACTGCAGCTGTACTAATGCTGTATTGG TTACCGTTTTTCAAAGGCTAGTAGTAATCATTCTTTG ACTTTGGATGCAATTGTTCGCAAGATCTATGCAATAA TGTGGCATAATGTGCTTGCTATCTCAGCCGGAATGTT CAACTTGACATGAATTTTTAATAAAACGGGAATGTTC TAAGAAATTATCGTAATGAACAAAAAAGATAAGTCGA CAGAAGTGTCACAATTCTAACTAGAACTTTAGTGAAG CCTAATGGTGAATTGCTACCATTAGACTTCATTAAAG TATTCATGGTACTAAAGATACTATTGGTAATAATGGT ACTAAACTAATGGTATTAATGGTACTAATGGTACTAA TGGTGTGAATTGTATGCGTGATAATGGTGTGAATGGT ACTAATGGTGTGAATGGAACTAATGGTGTGAATAGCA CTAATGGTGTGAATAGCATTAGTGGTGTGAATGGTAT GAATGGTACTATTGGTGGGAATGGTACTGATGGTATG AATGATACTAATTCCCTTGACTGAAAGTCAGGGTCTT ATGAAAGAAAATACCCCTTAAATGTCCGTAACGCTAA GTTCACTTTGATATTTTGAAATGTTCCTATATtGGCA AAAAACGTTAAATACAGAAAACGTCCGTACCCTTGTG GACTCGATAGCtCGAGTAaTtCTTTACcGATTTGCAA AATTTTGGTTTTATCCGAcGGaAAATGAAAATCaTGG aGGTTAAGTTCGTAGAATGGCCAAtaTTGGGGTATGa GATGGGaGTTATTCTCAaGGATTTTTTTTCTtGTTAC CCCCaCAtACCCCCCTCGagtcGG X IV C

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28 GINOGINIA Y ANDROGINIA EN Sciara coprophila Hembra ginogénica (productora de hembras) Hembra androgénica (productora de machos) Machos oocitos espermatozoides oocitos X’ X X X X A alelo constitutivo del factor materno Línea somática X’X XX XX X’X Hembra ginogénica Hembra androgénica Macho A W a s a s a s a s a s A W a s a s a s a s A W FM a s a s a s a s X’X X XX a s A W a s a s a s X’ a s a s a s FM W marcador dominante “wavy” s marcador recesivo “swollen” Gametos Línea germinal Línea somática a s Factor materno a s A W X’ X

29 HETEROCROMATINA DE Sciara coprophila X II III IV T29 T32 T23 T70 T1 H1 H2 H3 Helen V. Crouse Chromosoma X T1 II X T32 II X X T70 IV X X T29 IV X X

30 A BC maternal autosomes paternal autosomes paternal X chromosomes maternal X chromosome

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34 Eliminación del cromosoma X Xm Xp Xm Xp FM Xp Embrión hembra Xm Xp FM XpXp Embrión macho Eliminación del cromosoma X Xm Xp Xm Xp FC Xp Embrión hembra FC FM Xm XpXp Embrión macho Xm Xp FC FM FC MODELO DE UN FACTOR MODELO DE DOS FACTORES Factor materno Factor cromosómico

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36 Proposed elimination mechanisms Cytological events (Anaphase) Alterations in centromere kinetic activity. Aberrant anaphasic movement of chromosomes. Cecidomyiidae Chironomidae Lack of anaphasic movement of chromosomes. Failure of sister chromatid separation at centromeric regions. E Sciaridae Incomplete anaphasic movement of chromosomes. Failure of sister chromatid separation at chromosomes arms. E E E E E Chromosome elimination in the soma Alterations in centromere kinetic activity